凝胶
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gel ning jiao
又称冻胶。溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体（在干凝胶中也可以是气体），这样一种特殊的分散体系称作凝胶。没有流动性。内部常含有大量液体。例如血凝胶、琼脂的含水量都可达99%以上。可分为弹性凝胶和脆性凝胶。弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀，例如明胶等。脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时，形状和体积都不改变，例如硅胶等。由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为胶凝作用（gelation）。
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生物学和凝胶
生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
1.测定——分子量、PI
当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH.
2.选择——层析方法
若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
一] 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。
二] 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。
三] 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。
3.纯化——大量粗品
处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。
4.纯化——硫酸氨样品 硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。
5.纯水——糖类分子
固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。
6.纯化——膜蛋白
膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。
7.纯化——单抗、抗原 *单抗多为IgG.来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG.血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG.重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。
- 疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG.宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
- 纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。
- HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM.HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY.
8.纯化——重组蛋白 重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
一] GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
2. 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。
二] 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。
9.纯化——包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。
10.包涵体蛋白固相复性 *近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。
- 固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。
11.纯化——中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
- 生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
- 一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。
12.纯化——肽类
肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。医学都市多功能
13.纯化——核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、 SOURCE Q分离核酸。
14.纯化——寡核苷酸寡酸苷酸多应用在反义（anti-sense）DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脱盐、小分子去除
使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%.只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting（5ml）可用针筒操作。HiPrep Desalting（26ml）可在数分钟为多至10ml样品脱盐。
16.疫苗纯化 使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗，去除培养基中的杂蛋白，处理量可大于床体积10%.柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。
SORRCE 15Q
19.纯化-基因治疗用质粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游纯化中，可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时，去除各种污染物。
去除病毒
1.去除——内毒素
内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。
内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒（17-1349-01）可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL，PMB，自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。
胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。
利用核酸酶将核酸切成小片断，用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成为病原，应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D（solvent/detergent）处理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活，凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质，可去除多种微量污染物。
凝胶作用（冻胶）
凝胶是指颗粒大小在1埃到10埃之间的混合物。高分子溶液和某些溶胶，在适当的条件下，整个体系会转变成一种弹性的半固体状态的稠厚物质，失去流动性。这种现象称为胶凝作用,所形成的产物叫做凝胶或冻胶.
“气凝胶”是指分散系为气态的，如：云，雾等，“固凝胶”有烟水晶等，“液凝胶”就是呈液态的胶体，如氢氧化铁胶体 。
举例：
食品级葡甘露胶（Gum Konjac-GM）
葡甘露胶（又称：魔芋胶）系一种新型多用途微粒状可食用胶。这里推出之葡甘露胶是以优质魔芋中提取的葡萄甘露聚糖为原料，经脱杂处理后采用先进技术加工而成，其中添加成分不含任何非食用化学配料或色素。与传统的琼脂、果胶、海藻胶等食品添加剂相比，葡甘露胶在膨胀率、粘度、增稠、稳定性及使用方便程度上皆显著优于上述胶类，此外尚具有特殊的优点：无需添加任何凝固剂，在无糖、低糖或高糖条件下，在酸性、中性或碱性条件下，常温即可凝冻，凝胶性能理想；保持或强化了葡萄甘露聚糖所具有的降糖、降脂、减肥等保健功能，大大拓宽了魔芋应用的范围；价格低廉、使用方便。
葡甘露胶能广泛用于食品、饮料、医药、日用化工、科研等领域，作为琼脂、果胶、海藻胶等的替代产品，价格低廉，且使用时无需改变原有的设备及工艺，能大幅度降低添加剂的使用成本，是一种理想的新型凝胶添加剂。为满足不同产品开发的需要，
一、凝胶（果冻）型：
能与各种天然果汁、物料及色素良好混合，作为广谱凝胶赋型剂，是制作果冻、水晶软糖等的极佳原料，也可作为培养基支持体，且不需再添加其它任何胶类或碱性成份；凝胶成型条件随意、脱杯完整，凝胶强度高、韧性大。 用量：0.7～0.9%。用法：在适量温水中溶胀3～5分钟，煮沸冷至70度左右时加入糖及各种配料，冷却至室温即成。
二、培养基型：
用作替代琼脂作为花卉及其它植物进行组织培养的支持体。组培苗根粗、苗壮，使用效果理想，成本大幅降低。用量：0.5～0.6％。用法：在温水中溶胀3～5分钟，煮沸后冷却即可。 三、果肉（茶）饮料型：作为稳定剂与悬浮剂，替代琼脂和羧甲基纤维素等，广泛用于粒粒橙、果茶、果汁、豆奶、银耳羹、八宝粥等异相悬浮剂等（或混合）饮料中，防止沉淀或分层。 用量：0.15～0.25％左右。用法：在适量温水中充分溶胀后加入物料中。 四、冷冻制品型：用于冰棒、冰淇淋等各种冷冻制品，可增大膨胀，减少冰晶，提高抗热融性，使产品更加爽口。 用量：0.15～0.25％左右。用法：在适量温水中充分溶胀后加入物料中。 五、增稠型：用于果酱、米、面制品中，可增大膨胀率，提高韧性，改善赋型和口感。是进口洋槐豆胶的理想替代物。 用量：0.2～0.3％左右。用法：在适量温水中充分溶胀后加入物料中。
凝胶糖果
在凝胶糖果生产制造中，怎样才能够合理使用复配胶呢？
制作过程
首先，我们应该弄清相关的凝胶糖果制造的基本机理和凝胶剂之间的协同增效作用；其次是如何选择具有协同增效作用的凝胶剂进行合理的复配。否则，只将会事倍功半，甚至于会产生凝胶剂之间的拮抗作用，阻碍凝胶的形成，也就谈不上凝胶糖果的生产制造。
凝胶糖果可以看作是一种糖果溶液的凝胶体，而凝胶体的形成取决于凝胶剂的水合作用。因此，所有用于糖果的凝胶剂都必须是亲水性的胶体，当胶体分子的亲水基（-OH，-COOH等），吸持一定量的水份而形成水合作用，水作为溶剂分子复盖其上形成水化层，同时，胶体分子的非亲水基（-CH3、-CH2等）产生分子间的相互吸引力。有助于将单一胶粒形成线状分子并进而聚集成束状胶团。当凝胶从溶胶状态转为凝胶状态时，个别胶粒失去随意行动的能力，胶团与胶团之间开始结合成许多长链，长链逐渐相互交错，无定向地组成结，组成带和组成网，构成复杂的三维网络，构成了凝胶体的极为复杂的组织骨架，由于网络交界处形成很多空隙，并吸附大量的水分子，体积也随之膨胀变大，在一定条件下形成一种柔嫩、透明、光滑的冻胶状态，此时系统内的胶粒随意运动的倾向将会明显减弱，随着体系内水分子的进一步扩散，胶体的水化部位发生变化，其中部份胶束呈现定向的排列，并呈晶体结构，胶体间的紧密结合，冻胶状态又会逐渐变成凝胶状态。如果在形成凝胶状态的时候，我们将熬煮浓缩成一定浓度的糖浆加入，则糖类物质——多种碳水化合物的浓缩糖浆均匀地填满充实在凝胶错综复杂的网络空隙里，并使之固定化下来，从而形成一种非常稳定的含糖的凝胶。即使给予它较大的外来压力，也不会将其糖分子或水分子析出。如果我们再将其放置在一定的温、湿度的环境中，让体系内水分子进一步扩散、逃逸、蒸发。我们将得到的是质构非常坚固与紧密的含糖的凝胶体——凝胶糖果。
不同凝胶糖果的制造差别
不同的凝胶糖果的制造，其影响因素，工艺条件很多，成因又非常的复杂，这主要是因为不同凝胶剂的类型，分子结构，物理化学的性质都有很大的差异，不同的凝胶糖果的物料组成及其应用比例又各不相同，特别是选用两种或多种不同的凝胶剂来制造凝胶糖果。我们更需要弄清楚它们配伍之后会产生怎样的作用，是叠加协同增效作用；还是叠加减效拮抗作用？所以，我们在复配不同凝胶剂之前，应该弄清楚相关凝胶剂的特性，分子结构，然后再根据我们制造凝胶糖果所需要的工艺要求加以选择。优选复配胶的最佳组合和它们最佳的组合比例。
现以琼脂凝胶糖果为例。在许多的凝胶剂中，槐豆胶、角豆胶、黄原胶和明胶均与琼脂之间存在着协同增效作用。只是它们的增效程度和最佳添加比例范围不同，而瓜尔胶和果胶都与琼脂之间会产生拮抗作用。这主要是由于它们的分子结构所决定的。槐豆胶、角豆胶都是半乳甘露聚糖构成，以甘露糖残基为主链，平均每隔4个毗邻的甘露糖残基就连接一个半乳残基支链，但支链倾向于连接在一系列连续的甘露糖残基上形成“手发链段”和“光秃链段”，与琼脂双螺旋结合，交联，产生叠加增效效应。瓜尔胶虽然也是半乳糖残基，侧链密而短，不能与琼脂分子交联，反而会阻碍琼脂分子交联。果胶则是因为属直链高分子化合物，无明显的侧链基因，故无法与琼脂分子交联，反而会阻碍琼脂分子形成凝胶。在我们制造凝胶糖果过程中，选择哪些凝胶来进行复配就能起着协同增效效应，发挥各自优势，起着互补相衬的作用呢？除上述的琼脂凝胶糖果的实例外，据有关文献资料介绍，卡拉胶与槐豆胶按3:1～1:3的比例进行复配，可以提高、改善凝胶的强度和结构外，还能增强克服脱液收缩的现象，明胶与黄原胶，结冷胶合理复配，可以增强明胶糖果的弹性，提高其透明度，更为重要是可以添加果酸而不破坏其质构，大大改善明胶凝胶糖果的风味。在淀粉型糖果配料中，如果添加0.05%的黄原胶，可以改进加工性能，即在熬煮好混合糖液后，便可以立即急剧冷却成凝胶，大大缩短了凝胶形成时间，为改变传统的烘房干燥工艺创造了良好的条件。如果将明胶和魔芋甘露胶按3～4:1进行复配制造凝胶糖果，则可制得口感柔润、咀嚼性好，富有弹性，更光亮透明的明胶凝胶糖果。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
Native-PAGE原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下， 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法
非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非 变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制
1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；
2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；
5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；
6. 10％APS；
7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；
8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L
电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
染色和脱色:取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。
分离碱性蛋白
要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：
1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；
2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；
3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂
实验操作同分离酸性蛋白。
SDS-PAGE和Native-PAGE的比较
非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：
1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。
2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。
3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微
酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。
所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率。
问题和解答
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗？电泳1－2小时再加结合反应产物吗？
预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般30－60分钟后加样电泳。
2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？
步骤是：
（1） 固定：10%冰乙酸min。
（2） 清洗：双蒸水冲洗凝胶次，每次min。
（3） 染色：染色液（1g硝酸银，.5mL37%甲醛，1L双蒸水。现配）染色30min。
（4） 清洗：迅速洗凝胶次。
（5） 显影：30g碳酸钠，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。
成功银染的关键因素包括：
（6） 用超纯水（比如，NANOpure或Milli-Q纯化）或者是双蒸水作银染。
（7） 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。
（8） 在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，用不超过5-10秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。
（9） 甲醛和硫代硫酸钠（ul/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。
（10） 在使用前及时配染色液。
3. 变性PAGE的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性
PAGE的裂解液.具有操作步骤是什么?
非变性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬兰以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己
配。细胞超声即可，超声后离心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer为1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。还有一点就是要在配gel时考虑能使蛋
白多聚体稳定的因素。
4. 做了naive---PAGE没有条带，蛋白质是纯品，分子量很大，怎么回事呢？
因为分子量很大，8%的胶浓度较合适。加样时加个marker，可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏，如果蛋白是一种酶，且可使某种底物显色的话，可以用活性染色试试，更灵敏。
Native-PAGE注意几个问题
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要
的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；
3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;
4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。调整样品的PH在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外，加入样品后不能加热.
芦荟凝胶
成分
主要有芦荟大黄素，芦荟蒽酮，多种糖类、酶、氨基酸等组成。为淡黄绿色液体，相对密度为0.98～1.02，pH值4～6。
用途
主要用于化妆品(完美芦荟胶）中的皮肤、头发保护用品，具有保湿、防晒、防臭、防肥胖、软化皮肤，消炎止痒，防粉刺、雀斑等功效。也可用于医药和食品中。
气凝胶（aerogels）
气凝胶（aerogels）没有明确而固定的定义，气凝胶通常是指以纳米量级超微颗粒相互聚集构成纳米多孔网络结构，并在网络孔隙中充满气态分散介质的轻质纳米固态材料。
美国斯坦福大学的S.S.Kistler首先用水玻璃通过溶胶-凝胶方法及超临界干燥技术制得SiO2气凝胶。
按其组分，可分为单组分气凝胶，如SiO2，Al2O3，TiO2，炭气凝胶（有机气凝胶炭化后得到）等；多组分气凝胶，如SiO2/Al2O3，SiO2/TiO2等。最典型的研究最多的气凝胶是单组份的SiO2气凝胶和炭气凝胶（有机气凝胶）。右图为有机气凝胶。
气凝胶（aerogels）与干凝胶（xerogels）并非同一概念，国外相关文献指出，湿凝胶经过超临界干燥得到的是气凝胶，经过常压干燥得到的是干凝胶。严格讲，气凝胶应是块状结构，而干凝胶一般是粉体或者颗粒。
气凝胶因其半透明的色彩和超轻重量，有时也被称为“固态烟”或“冻住的烟”。这种新材料看似脆弱不堪，其实非常坚固耐用，不同成份的气凝胶可以承受不同的温度，常见的氧化硅气凝胶可以在绝对零度到650℃的范围内使用，有些类型的气凝胶最高能承受1400℃的高温。气凝胶的这些特性在航天探测上有多种用途。俄罗斯“和平”号空间站和美国“勇气号”火星探测器上，都用到了气凝胶材料。
气凝胶是吉尼斯世界纪录里最轻的固体。
制备方法
不同气凝胶的制备方法也不相同。但是其制备历程大同小异，一般是采用溶胶-凝胶法制备湿凝胶（wet gel），湿凝胶经溶剂置换和超临界工作得到相应的气凝胶。
气凝胶的特点
(1)孔隙率很高，可高达99.8%；科学家们表示，因为它有数百万小孔和皱摺，所以如果把1立方厘米的气凝胶拆开，它会填满一个有足球场那么大的地方。它的小孔不仅能像一块绵一样吸附污染物，还能充当气穴。研究人员认为，一些形式的由铂金制成的气凝胶能用于加速水解及氢的产生。这样的话，气凝胶就能用来生产以氢为基础的燃料。
(2)纳米级别孔洞(~20nm)和三维纳米骨架颗粒(2~5nm)；
(3) 高比表面积，可高达1000m2/g；
(4) 低密度，可低至0.003g/cm3。
（5）气凝胶独特的结构决定了其具有极低的热导率，常温下可以低至0.013W/(m.K)，比空气的导热系数还低。
（6）强度低，脆性大，由于其比表面积和孔隙率很大，密度很低，导致其强度很低。如SiO2气凝胶杨氏模量不到10MPa，抗拉强度只有16KPa，断裂韧度只有0.8kPa.m1/21)孔隙率很高，可高达99.8%；科学家们表示，因为它有数百万小孔和皱摺，所以如果把1立方厘米的气凝胶拆开，它会填满一个有足球场那么大的地方。它的小孔不仅能像一块绵一样吸附污染物，还能充当气穴。研究人员认为，一些形式的由铂金制成的气凝胶能用于加速水解及氢的产生。这样的话，气凝胶就能用来生产以氢为基础的燃料。
(2)纳米级别孔洞(~20nm)和三维纳米骨架颗粒(2~5nm)；
(3) 高比表面积，可高达1000m2/g；
(4) 低密度，可低至0.003g/cm3。
（5）气凝胶独特的结构决定了其具有极低的热导率，常温下可以低至0.013W/(m.K)，比空气的导热系数还低。
（6）强度低，脆性大，由于其比表面积和孔隙率很大，密度很低，导致其强度很低。如SiO2气凝胶杨氏模量不到10MPa，抗拉强度只有16KPa，断裂韧度只有0.8kPa.m1/2
气凝胶应用
1.超级绝热材料
材料的热传导由气态传导、固态传导和热辐射传导决定。由于气凝胶材料具有纳米多孔结构,因此常压下气态热导率λg很小,真空下热传导由固态传导和热辐射传导决定。同玻璃态材料相比,纳米多孔材料由于高孔隙限制了稀疏骨架中链的局部激发的传播,使得固态热导率λs仅为非多孔玻璃态材料热导率的1/500左右。Nilsson等检测室温下气凝胶热导率为0.013~0.016W/(m.K),静态空气的热导率为0.024W/(m.K),即使在800℃的高温下其导热系数才为0.043W/(m.K),是目前隔热性能最好的固态材料。
（1）太阳能热水器
太阳能热水器及其他集热装置的高效保温成了能否进一步提高太阳能装置的能源利用率和进一步提高其实用性的关键因素。将纳米孔超级绝热材料应用于热水器的储水箱、管道和集热器，将比现有太阳能热水器的集热效率提高1倍以上，而热损失下降到现有水平的30%以下。
（2）在热电池上应用
可延长热电池的工作寿命,防止生成的热影响热电池周围的元器件。
（3）军事及航天领域
与传统绝热材料相比，纳米孔气凝胶超级绝热材料可以用更轻的质量、更小的体积达到等效的隔热效果。这一特点使其在航空、航天应用领域具有举足轻重的优势。如果用作航空发动机的隔热材料，既起到了极好的隔热作用，又减轻了发动机的重量。作为外太空探险工具和交通工具上的超级绝热材料也有很好的应用前景。
凝胶在航天中的应用远不止这些，美国国家宇航局的“星尘”号空间探测器已经带着它在太空中完成了一项十分重要的使命———收集彗星微粒。
星尘号上的气凝胶方阵
科学家认为，彗星微粒中包含着太阳系中最原始、最古老的物质，研究它可以帮助人类更清楚地了解太阳和行星的历史。2006年，“星尘”号飞船将带着人类获得的第一批彗星星尘样品返回地球。
但收集彗星星尘并不是件容易的事，它的速度相当于步枪子弹的6倍，尽管体积比沙粒还要小，可是当它以如此高速接触其它物质时，自身的物理和化学组成都有可能发生改变，甚至完全被蒸发。如今科学家有了气凝胶，这个问题就变得很简单了。它就像一个极其柔软的棒球手套，可以轻轻地消减彗星星尘的速度，使它在滑行一段相当于自身长度200倍的距离后慢慢停下来。在进入“气凝胶手套”后，星尘会留下一段胡萝卜状的轨迹，由于气凝胶几乎是透明的，科学家可以按照轨迹轻松地找到这些微粒。
（4）工业及建筑绝热领域
在工业及民用领域纳米孔超级绝热材料有着广泛和极具潜力的应用价值。首先,在电力、石化、化工、冶金、建材行业以及其他工业领域，热工设备普遍存在。工业节能中,纳米孔超级绝热材料也起着非常重要的作用,其中有些特殊的部位和环境，由于受重量、体积或空间的限制,急需高效的超级绝热材料。
2.在催化剂以及催化载体方面的应用
气凝胶是一种由超微粒子组成的固体材料,具有小粒径、高比表面积和低密度等特点,使SiO2气凝胶催化剂的活性和选择性远远高于常规催化剂,而且它还可以有效减少副反应的发生。Kister制备出SiO2气凝胶后不久就指出，气凝胶因其高的孔隙率、比表面积和开放的织态结构,在催化剂和催化载体方面具有潜在的应用价值，但因小的热导率和低的渗透性影响了气凝胶在催化反应中的传热和传质，使其应用受到限制。
3.在其它方面的应用
SiO2气凝胶具有极高的比表面积和孔隙率,近年来被广泛应用于Cerenkov探测器中,以探测高能带电粒子和在太空中捕集陨石微粒的介质材料。SiO2气凝胶也曾一度被用于等离子体研究中作为惯性限制熔融试验体目标组分。因其具有低的表观密度和热导率,极好的耐高温性能,气凝胶作为高效隔热消音材料很有前途。
由轻原子量元素组成的低密度、微孔分布均匀的SiO2气凝胶对氖具有良好的吸附性能,因而为惯性约束聚变实验研制高增益靶提供了一个途径,这对于利用受控热核聚变反应来获得廉价、清洁的能源具有重要意义。
4.气凝胶在日常生活中的应用
气凝胶也正走进我们的日常生活。运动器材公司邓禄普(Dunlop)已经研制出一系列用气凝胶加固的壁球和网球球拍，据说这种球拍能释放更大的力量。今年初，英国诺丁汉66岁的鲍勃.斯托克尔拥有了一套用气凝胶隔热的房子，他也因此成为拥有这种房子的第一位英国人。他说：“保温效果大大改善了。我把自动调温器调低了5度。这真是一个不可思议的变化。”
登山者也开始从气凝胶中受益。去年，一位英国登山者安妮.帕曼特尔穿上带气凝胶鞋垫的靴子爬上珠穆朗玛峰，就连睡袋也加有这种材料。她说：“我唯一的问题就是我的脚太热，这对一名登山者来说是一个大难题。”
不过，它还没能征服时尚界。Hugo Boss公司推出了一系列用这种材料制成的冬季夹克，但在消费者纷纷抱怨这种衣服太热之后不得不下架。
在环境保护及化学工业方面，纳米结构的气凝胶还可作为新型气体过滤 ，与其它材料不同的是该材料孔洞大小分布均匀，气孔率高，是一种高效气体过滤材料。由于该材料特别大的比表而积．气凝胶在作为新型催化剂或催化剂的载体方而亦有广阔的应用前景。
5.在电化学方面的应用
在储能器件方而，有机气凝胶经过烧结工艺处理后将得到碳气凝胶 这种导电的多孔材料是继纤维状活性碳以后发展起来的一种新型碳素材料，它具有很大的比表面积(600—1000 m2／g)和高电导率(10~25 s／cm)．而目．密度变化范围广(0.05~1.0 g／cm3)．如在其微孔洞内充人适当的电解液，可以制成新型可充电电池，它具有储电容量大、内阻小、重量轻、充放电能力强、可多次重复使用等优异特性，初步实验结果表明：碳气凝胶的充电容量达3×104／kg2，功率密度为7 kw／kg，反复充放电性能良好。
6.储氢材料
氢能具有很高的热值，燃烧释能后的产物是水，对环境无污染，此外，氢能为可再生能源，不会枯竭，
因而被誉为21世纪的绿色新能源。美国Lawrence Livermore国家实验室和伊利诺斯大学研究表明：炭气凝胶具有高比表面积、低密度、连续的网络结构且孔洞尺寸很小又与外界相通，具有优良的吸、放氢性能。美国能源部于2005年专门设立了机构，研究掺杂金属的炭气凝胶贮氢，并给予财政资助。
7.气体或者液体吸附
气凝胶还可以用作吸附材料，不如吸附CO2气体，吸附一些化学有毒蒸汽，吸附炸药废水等。
研究机构
目前国际上关于气凝胶材料的研究工作主要集中在德国的维尔茨堡大学、BASF公司、美国的劳伦兹.利物莫尔国家实验室、桑迪亚国家实验室，法国的蒙彼利埃材料研究中心，日本高能物理国家实验室，美国aspen公司，美国宇航局等。国内主要集中在同济大学波尔固体物理实验室、国防科技大学、绍兴纳诺高科、英德埃力生、山东科技大学等。
国内外工业化生产情况
作为新兴纳米材料，目前世界能工业生产的企业不多，国际上较知名的有美国的ASPEN和CABOT，国内进行气凝胶商业化的企业有浙江绍兴的纳诺高科股份有限公司，英德市的埃力生亚太电子有限公司。
凝胶护肤品
天然凝胶是存在于植物凝胶（海和陆地的植物）、动物凝胶、高山凝胶（矿物）等大自然中，是自然界存在的粘质，但又具有它们各自的特性。从这些天然物质中提炼出来的全新凝胶成分，多种凝胶成分相互组合，让肌肤体验一种从未有过的感觉。
从纤维素、植物种子和矿物天然物质中提炼出来的全新凝胶成分，将其中的粘质体通过生化工程，合成肌肤中真正需要的细胞间脂质。
深海凝胶： 含丰富的维他命，微量矿物元素，有效预防老化。
植物凝胶： 促进皮肤的再生，具有消炎，镇静的功能。
高山凝胶： 具有杀菌、防腐的功能和良好的吸附能力。
动物凝胶： 活化细胞、增加肌肤的弹性及保湿能力。
针对皮肤干燥问题，以及挥之不去的肌肤烦恼，迄今为止的化妆品主要是补充水分和油分，并没有满足肌肤真正需要，人的皮肤细胞中与自然界凝胶有着同样的保湿功能，这就是凝胶重要的品质因素。天然凝胶具有良好的透气性来实现滋润与锁水，让肌肤保持持久的亲肤性。
目前，凝胶护肤品以其天然、安全、无油、无添加而风靡日本美容界，如诚美的“细胞源”原装进口系列产品。在中国，凝胶护肤品处于刚刚起步阶段，比较知名的如jeru肌如凝胶护肤品。但可以预见，在不远的将来，凝胶护肤品将受到越来越多中国爱美人士的青睐。
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