临床生物化学/核酸扩增技术

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临床生物化学

诊断分子生物学基本技术
- 分子生物学实验诊断技术
  - 核酸杂交技术
  - 核酸扩增技术
  - 核酸限制性片段长度多态性（RFLP）分析
  - 核酸一级结构（核苷酸序列sequence）分析

通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒，也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法，是在90年代才开展起来的多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便，在我国发展很快。目前，PCR技术结合分子生物学实验技术（如逆转录反应杂交技术等）开发了许多PCR新技术（reverse transcriptase PCR；PCR-single strandconformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；热启动PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于点突变分析；二次PCR特异性好，灵敏度高；热启动PCR可提高特异性。

PCR技术原理是在了解DNA一级结构基础上设计引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可识别并结合引物，以单链DNA为模板，dNTP为底物，合成其互补链。通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到DNA扩增的目的。人的DNA扩增引物长度多为20个核甘酸。（图18-7）

PCR技术原理

图18-7　PCR技术原理

PCR反应：DNA样品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，gelatin（明胶）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，矿物油一滴。93℃7分钟→50-55℃2分钟→70-72℃3-1.5分钟→93℃2分钟。

将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳，紫外光下观察结果，拍照保存结果。反应物也可用于印迹（杂交）实验、多态分析、探针制备等。

注意事项：①DNA样品纯度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆转录酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内（特别3′端）和引物，1，2分子间不形成双链。选择性好，不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G+C含量为40％-60％。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误，一般在200μmol/L，有人建议40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L对酶有抑制作用。Mg²⁺浓度过高，NDA不易变性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶从嗜热菌分离得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶），现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3～8.8（室温8.3-8.4），反应温度75-80℃，95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性，对SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐温－20可抵制SDS抑制）。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm－5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性退火，而造成非特异扩增，此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多，增加次数可提高灵敏度，但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高，被检样品极易被污染，样品纯化，扩增，检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃，处理。