生物化学与分子生物学/DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子
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DNA 的复制实际上就是以 DNA 为模板在 DNA聚合酶 作用下，将游离的四种脱氧 单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP, 简写为 dNTP) 聚合成 DNA 的过程。
这是一个非常复杂的 酶促反应，需要许多种酶和 蛋白质 参与，现分别叙述它们在 DNA 复制中作用。
(一)DNA 的聚合反应和 DNA 聚合酶
图 16－9 DNA 聚合酶的作用
1957 年，Arthur kornberg 首次在 大肠杆菌 中发现 DNA 聚合酶Ⅰ，(DNa polymerase Ⅰ, 简写 DNA polⅠ) 后来又相继发现了 DNA 聚合酶Ⅱ和 DNA 聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ，Ⅲ，简写 DNA polⅡ,DNA polⅢ) 实验证明大肠杆菌中 DNA 复制的主要过程靠 DNa polⅢ起作用，而 DNA polⅠ和 DNA polⅡ在 DNA 错配的校正和修复中起作用。见表 16－1。
这种酶的共同性质是：①需要 DNA 模板，因此这类酶又称为依赖 DNA 的 DNA 聚合酶 (DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要 RNA 或 DNA 做为 引物(primer)，即 DNA 聚合酶不能从头 催化DNA 的起始。③催化 dNTP 加到引物的 3′桹 H 末端，因而 DNA 合成的方向是 5′→3′。图 16-9。④三种 DNA 聚合酶都属于 多功能酶，它们在 DNA 复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于 DNA 聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他 DNA 聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍 DNa polⅠ的作用并指出另外二种 DNA pol 的特殊性：
1.DNA 聚合酶Ⅰ：
DNA polⅠ是由一条 多肽 链组成，分子量 为 109KD。酶 分子 中含有一个 Zn++，是聚合活性必须的。
大肠杆菌每个 细胞 中约有 400 个酶分子，每个酶分子每分钟在 37℃下能催化 667 个 核苷酸 参入到 DNA 链中，用 枯草杆菌蛋白酶 可将此酶水介成两个片段，大片段分子量为 76KD，通常称为 klenow 片段，小片段为 34KD。大小片段具有不同的 酶活性。
(1)DNA 聚合酶的 5′→3′聚合活性：
这是 DNA 聚合酶最主要的活性，按模板 DNA 上的核苷酸顺序，将互补的 dNTP 逐个加到引物 RNA3′桹 H 末端，并促进 3′桹 H 与 dNTP 的 5′桺 O4 形成 磷酸二酯键，酶的 专一性 表现为新进入的 dNTP 必须与模板 DNA碱基配对 时才有催化作用，5′→3′聚合活性存在于 klenow 片段上 (图 16－9 和图 16-10)。
图 16-10 DNA 聚合酶催化的 DNA 链延长
(2)DNA 聚合酶的 3′→5′外切 核酸酶 活性：
这种酶活性的主要功能是从 3′→5′方向识别并切除 DNA 生长链末端与模板 DNA 不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于 DNA 复制中极高的保真性是至关重要的。
(3)DNA 聚合酶的 5′→3′外切核酸酶活性：
这种酶活性是从 DNA 链的 5′端向 3′末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除 10 个核苷酸。因此，这种酶活性在 DNA 损伤的修复中可能起重要作用，对完成的 DNA 片段去除 5′端的 RNA 引物也是必须的。
DNA polⅠ的 5′→3′聚合活性和 5′→3′外切酶活性协同作用，可以使 DNA 一条链上的切口从 5′→3′方向移动，这种反应叫做缺刻平移 (nick translation)，利用此反应可在体外对 DNA 片段进行 放射性 磷 (α-32PdNTP) 的标记制成 探针(probe)，进行 核酸 的 分子杂交 实验，是现代分子 生物学 的一项重要技术 (图 16－11)。
图 16-11 缺刻平移标记 DNA 探针
许多实验证实 DNA polⅠ并不是 DNA 复制过程中的主要酶，它的作用主要与 DNA 损伤后的修复有关。
2.DNA 聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)
此酶分子量为 120KD，每个细胞约有 100 个酶分子，但活性只有 DNa polⅠ的 5%，它具有 5′→3′聚合活性和 3′→5′外切活性，而没有 5′→3′外切活性，它的作用可能与 DNA 损伤修复有关。
3.DNA 聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)
图 16－12 DNA 聚合酶Ⅲ催化先导链和随从的合成
这是在 DNA 复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个 亚基 组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa 整个酶分子形成一个不对称的 二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有 10?0 个酶分子，但催化 dNTP 参入 DNA 链的速率却是最快的，约为 9000 核苷酸 / 每分钟 / 每个酶分子。这也证明 DNa polⅢ是 DNA 复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌 染色体DNA 进行复制时，DNA 聚合酶Ⅲ全酶 并不是单独起作用的，而是与 引发体，介 链酶 等构成一个复制体 (replisome)。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNa polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制，在φ×174 的复制中观察到引发体总是伴随着 DNA 噜噗 (loop) 的存在。图 16?2 可以看到，由于随从链的模板 DNA 在 DNA 聚合酶Ⅲ全酶上绕转了 180°而形成一个噜噗，因此岗崎片段的合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。
随着 DNA polⅢ向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断延长，这一噜噗也在不断扩大。当岗崎片段合成到前一个片段的 5′端时，这一大噜噗就释放出来，由于 复制叉 向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后再形成一个小的噜噗，进行新的岗崎片段的合成。由此模型不难看出：随从链的合成需要 周期性 的引发，因此其合成进度总是与 前导链 相差一个岗崎片段的长度。岗崎片段完成后，其 5′端的 RNA 引物由 DNa polⅠ的 5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由 DNA polⅠ的 5′→3′聚合活性催化 dNTP 得到填补。所以 DNA 的复制是在 DNa polⅢ和 DNApolⅠ互相配合下完成的。
下面列表说明三种大肠杆菌 DNA 聚合酶的特性
表 16－1 大肠杆菌 DNA 聚合酶特征
| DNA 聚合酶Ⅰ | DNA 聚合酶Ⅱ | DNA 聚合酶Ⅲ | |
| 分子量 | 109KD | 120KD | ＞600KD |
| 每个细胞中的分子数 | 400 | 17-100 | 10-20 |
| 5′→3′聚合活性 | + | + | + |
| 37℃转化率核苷酸数／酶分子. 分钟 | 600 | 30 | 30,000 |
| 5′→3′外切活性 | + | - | - |
| 3′→5′外切活性 | + | + | + |
| 切刻平移活性 | + | - | - |
| 对 dNTP 亲和力 | 低 | 低 | 高 |
| 功能 | 修复 | 不详 | 复制 |
| 去除引物 | |||
| 填补空缺 |
真核生物DNA 聚合酶
真核生物 DNA 聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它们的基本特性相似于大肠杆菌 DNA 聚合酶，其主要活性是催化 dNTP 的 5′→3′聚合活性，基本特征见表 16－2。
表 16-2 真核生物 DNA 聚合酶
| α | β | γ | δ | ε | |
| 亚基数 | 4 | 4 | 4 | 2 | 5 |
| 分子量（KD) | ＞250 | 36-38 | 160-300 | 170 | 256 |
| 细胞内定位 | 核 | 核 | 线粒体 | 核 | 核 |
| 5′→3′聚合活性 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 3′→5′外切活性 | － | － | － | － | － |
| 功能 | 复制、引发 | 修复 | 复制 | 复制 | 复制 |
真核细胞 在 DNA 复制中起主要作用的是 DNA polα，主要负责染色体 DNA 的复制。DNa polβ的模板特异性是具有缺口的 DNA 分子，被认为它与 DNA 修复 有关。DNa polγ在线粒体 DNA 的复制中起作用。DNA polδ不但有 5′→3′聚合活性，而且还具有 3′→5′外切酶活性，据认为真核生物 DNA 复制是在 DNa polα和 DNA polδ协同作用下进行的，前导链的合成靠 DNA polδ催化，并且还需要一种 细胞周期 调节因子椩鲋诚赴丝乖?proliferatingcell nucleus antigen, PCNA) 参与。而随从链的合成靠 DNA polα和 引发酶 配合作用完成。
(二) 与 超螺旋 松驰有关的酶：
DNA 复制从起始点开始向一个方向复制时，局部的 DNA 双链必须打开，主要靠 解链酶 的作用，打开后的 单链 还需要单链 结合蛋白 与其结合，在复制叉向前移动时造成其前方 DNA 分子所产生的正超螺旋，必须由 拓扑异构酶 来解决。下面分别介绍它们的作用。
拓扑异构酶 (topoisomerase) 是一类改变 DNA 拓扑性质的酶。在体外可催化 DNA 的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了 DNA 的复制与 转录。在 DNA 复制时，复制叉行进的前方 DNA 分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及 DNA 的合成。DNA 复制完成后，拓扑酶又可将 DNA 分子引入超螺旋，使 DNA 缠绕、折叠，压缩以形成 染色质。DNA 拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于 原核生物 及真核生物中。表 16－3
表 16－3 大肠杆菌和真核 生物 中的拓扑异构酶
| 类型 | 作用 | 对超螺旋的作用 |
| Ⅰ型拓扑异构酶 | ||
| 大肠杆菌 | 切开一股 DNA 链 | 松驰负超螺旋 |
| 真核生物 | 切开一股 DNA 链 | 松驰正，负超螺旋 |
| Ⅱ型拓扑异构酶 | ||
| 大肠杆菌 | 切开二股 DNA 链 | 构驰正超螺旋； |
| 依赖 ATP | 引入负超螺旋， | |
| 解环连等 | ||
| 真核生物 | 切开二股 DNA 链 | 松驰正超旋， |
| 依赖 ATP | 但不能引入负超螺旋 |
拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ) 的主要作用是将环状双链 DNA 的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使 DNA 复制叉移动时所引起的前方 DNA 正超螺旋得到缓解，利于 DNA 复制叉继续向前打开。拓扑异构酶Ⅰ除上述作用外，对环状 单链 DNA 还有打结或解结作用，对环状双链 DNA 的环连或解连以及使环状单链 DNA 形成环状双链 DNA 都有作用 (图 16－13)。
图 16－13 拓扑酶Ⅰ及Ⅱ的作用特点
(a) 大肠杆菌拓扑酶Ⅰ催化的 4 种拓扑异构化作用 (b) 拓扑酶Ⅱ的作用
拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ) 是在大肠杆菌中发现的，曾被称为 旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链 DNA 的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口，TopoⅡ还可使 DNA 分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要 ATP 参与。DNA 复制完成后，TopoⅡ在 ATP 参与下，DNA 分子从松驰状态转变为负超螺旋。此外，TopoⅡ催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连，以及打结或解结。
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