基因诊断与性病/支原体性感染症

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基因诊断与性传播疾病

非淋菌性泌尿生殖道炎
- 衣原体感染症
- 支原体性感染症

生殖器支原体（Mycoplasmasemtalium）感染是近年新明确的一种性接触传播疾病。

支原体（Mycoplasmal）是目前所能发现的能在无生命培基中生长繁殖的最小的微生物。它广泛分布于自然界，有80余种，与人类有关的支原体有肺炎支原体（M-pneumonie，Mp）、人型支原体（M.humenis，MH）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，UU）和生殖器支原体（M.genitalium，MG），前者引起肺炎，后三者引起泌尿生殖道感染。支原体体形多样，基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，其菌落呈针尖大小，故又称之为微小支原体。支原体特点是无细胞壁及前体，细胞器极少。DNA的G+C含量低，菌体内具有非常小的染色体组，其分子量约为45×108，菌体细胞大小约为0.2-0.3μm，很少超过1.0μm。由三层蛋白质和脂质组成的膜样结构以及一层类似毛发结构组成。支原体由二分裂繁殖，形态多样。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养。营养要求比细菌高。由于它没有细胞壁，因此对影响细胞壁合成的抗生素，如青霉素等不敏感，但红霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素，可抑制或影响支原体的蛋白质合成，有杀伤支原体作用，支原体对热抵抗力差，通常55℃经15分钟处理可使之灭活。石碳酸，来苏儿易将其杀死。在培养基中置入脲素并以硫酸锰作指示剂极易与其他支原体作出鉴别。

二、流行病学

由于诊断条件所限和命名上的问题。国内尚无系统的人群调查资料，支原体可存在于健康携带者，而在性乱者、同性恋、妓女、淋病患者中检出率较高，我国报道7个地区健康人携带率为解脲支原体（UU）占10.59%，人型支原体（MH）占5.34%。性乱者UU的检出率为71.7%，MH为19.57%。调查表明，性伴数越多，性活跃指数越大，UU和MH感染率越高。

三、传播途径

成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染部位在尿道粘膜，女性感染部位在宫颈。新生儿主要引起结膜炎和肺炎。

四、发病机理与免疫

支原体只能粘附在呼吸道或泌尿生殖道的上皮细胞表面的受体上，而不进入组织和血液。支原体引起细胞损害的原因为：粘附于宿主细胞表面的支原体从细胞吸收营养，从细胞膜获得脂质和胆固醇，引起细胞损伤；支原体代谢产生的有毒物质，如溶神经支原体能产生神经毒素，引起细胞膜损伤；脲原体含有尿素酶，可以水解尿素产生大量氨，对细胞有毒害作用。支原体除可以粘附于细胞、巨噬细胞表面外，还可以粘附于精子表面，从而阻止精子运动，其产生神经氨酸酶样物质可干扰精子与卵子的结合。这就是支原体感染引起不育不孕的原因之一。

在动物实验发现，小鼠腹腔巨噬细胞可以杀灭支原体，而中性粒细胞的作用不大。在体外，IgG1和IgG2抗体有调理作用。可加强巨噬细胞对支原体的杀伤作用。

五、临床表现

潜伏期为1-3周，典型的急性期症状与其他非淋病性生殖泌尿系统感染相似，表现为尿道刺痛，不同程度的尿急及尿频、排尿刺痛，特别是当尿液较为浓缩的时候明显。尿道口轻度红肿，分泌物稀薄，量少，为浆液性或脓性，多需用力挤压尿道才见分泌物溢出，常于晨起尿道口有少量粘液性分泌物或仅有痂膜封口，或见污秽裤裆。约有三分的病人可无任何自觉症状。只是在例行检查时才被发现。50%病人初诊被忽略或误诊，约有10%-20%的患者同时有淋球菌双重感染。

亚急性期常合并前列腺感染，患者常出现会阴部胀痛、腰酸、双股内侧不适感或在做提肛动作时有自会阴向股内侧发散的刺痛感。肛诊时前列腺纵沟不明显或表面类似核桃壳凹凸不平，少数病例B型超声波诊断可证实不同程度的增大。合并副睾炎者不多见。

女性患者多见以子宫颈为中心扩散的生殖系炎症。多数无明显自觉症状，少数重症病人有阴道坠感，当感染扩及尿道时，尿频、尿急是引起病人注意的主要症状。感染局限在子宫颈，表现为白带增多、混浊、子宫颈水肿、充血或表面糜烂。感染扩及尿道表现为尿道口潮红、充血、挤压尿道可有少量分泌物外溢，但很少有压痛出现。

支原体感染常见的合并症为输卵管炎，少数患者可出现子宫内膜炎及盆腔炎。

六、诊断及鉴别诊断

（一）临床诊断

有不洁性交史，有尿道、阴道分泌物及排尿灼痛表现者而又排除其他病原体感染的可能性，取尿道或宫颈分泌物涂片，在1000倍显微镜下可见多形核白细胞≥5个，可作初步诊断。

（二）实验诊断

支原体感染的实验室诊断主要是支原体的培养和血清学鉴定，目前主要采用基因诊断。

1．支原体培养：

a．采集标本，一般为泌尿生殖试子或刷片，少数取前列腺液，精液、关节液，或取输卵管，直肠活检物，近年来用初段尿标本离心物，以取代尿道拭子。拭子取材时，将拭子插入男性尿道2-4cm，用力擦取。该方法容易造成尿道损伤及继发感染。用时须慎重。女性则需先清洁宫颈鳞状与柱状上皮结合部，用细胞刷收集宫颈标本，能增加感染细胞的数量，较棉拭子敏感性高。

b．常用培养基为牛心浸液或蛋白胨，并含1%新鲜酵母浸液，10-20%动物血清及0.5%氯化钠，还可加葡萄糖和精氨酸以促进MH和MG生长，加入尿素以供UU代谢，适量加青霉素抑制杂菌。

2．血清学鉴定法：最常用的是琼脂扩散法，即将支原体接种到琼脂皿上。然后再用浸过适量血清的滤纸放到琼脂表面，观察哪一种能抑制支原体生长。也可用琼脂表面的菌落作荧光抗体染色法，用落射荧光显微镜观察，此法的优点是可以利用最初生长在琼脂表面上的菌落而不必将支原体传代。

血清学诊断试验：酶联免疫吸附试验（ELISA）敏感性高：微量免疫荧光法（MIF）具有快速特点。

3．基因诊断：利用DNA探针对支原体诊断其敏感性稍差，但特异性高，用聚合酶链反应（PCR），敏感性、特异性均高。具体检测方面如下：

（1）标本处理

1．取材部位为子宫颈管，男性为尿道，将灭菌白金耳深入宫颈管或尿道1cm左右，转动数圈，停留约30s，取出后置标本缓冲液中。

2．解脲脲原体DNA提取：

将宫颈管内或尿道内刮取物置含0.5%NP-40、0.5%Tween20，1%SDS和2mg/ml蛋白酶K的TES缓冲液（50mmol/l Tris-HCl，50mmol/L NaCl，100mmol/ L EDTA，pH 8.0），置37℃裂解60 min，沸水5min，酚，氯仿抽提DNA乙醇沉淀，沉淀物溶于20μl TE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。

（2）引物设计

引物来源于解脲脲原体，脲酶基因序列：

UU1：CAGATACATTAAACGAAGCAGG（1613-1635）

UU2：GTGGTGACATACCATTAAC（1837-1819）

（3）PCR扩增

传统的方法为的反应体积为100μl，含5x反应缓冲液20μl和FD-DNA聚合酶2μ、4种dNTP各200μmol/L以及引物对各25pmol/L。上述成分预先一次性分装于0.5ml离心管，-20℃备用。临用加模板DNa 2μl，短暂离心，加100μl矿物油覆盖。现在试剂已商品化，反应体积为25μl，单管已分装好，只要加入模板DNA即可。置DNA扩增仪进行40次循环扩增。每次循环包括90℃变性45s(第一次循环变性2min)，55℃退火30s和72℃延伸40s（最后一次循环72℃，延伸5min）三个步骤。每次扩增均应作阴阳性对照。

（4）扩增产物的检测

1．1.5%琼脂糖凝胶电泳检测：取10u lPCR扩增物作1.5%琼脂糖凝胶电泳、0.5μg/ml溴化乙锭染色，以PGEM-3Zf（+）DNA-Hae Ⅲ为分子量标准，置紫外透射仪观察结果。

2. 治疗：治疗基本同衣原体治疗。强力霉素100mg口服，每日2次，连服7-14天或阿齐霉素1g，单剂量口服，半衰期长达60小时，一次口服，可维持有效浓度5天；氟嗪酸0.2，口服，每日2次，连服7-14天。