单克隆抗体技术
| A+医学百科 >> 单克隆抗体技术 |
单克隆抗体技术(monoclonal antibody technology)，20世纪后期免疫学技术的重大突破，应用B细胞杂交瘤技术产生单克隆抗体(McAb)。 B细胞杂交瘤是免疫的小鼠脾细胞 （B淋巴细胞）与小鼠骨髓瘤（一种浆细胞瘤，浆细胞是B淋巴细胞系的终末形式）细胞融合而成的杂交细胞，其核内含有双亲细胞的染色体，继承了亲代细胞的特征，它既具有瘤细胞在体外培养中迅速增殖的能力，又具备免疫脾细胞合成和分泌特异性抗体的特性。B细胞杂交瘤经过单个细胞培养，可繁殖成为一个细胞系（称为克隆或克隆系），这个过程称为克隆化，而由一个克隆系产生的抗体称单克隆抗体。这种抗体只能特异地与抗原分子上的一个抗原决定簇结合反应，抗体成分均一，抗体的结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，且在培养过程中只要不发生变异，不同时间内分泌的抗体都能保持同样的结构和功能。因此，用这种技术可按人们的意愿生产大量很纯的单克隆抗体，这些都是用普通血清学方法所不能达到的。这技术在医学和生物学各个领域中得到广泛应用，并为临床疾病的诊断、治疗提供了新手段。带有多个抗原决定簇的抗原分子注入动物体内，被带有相应抗原决定簇受体的淋巴细胞所识别，它们活化、增殖，每一个 B细胞系分别分泌针对单个抗原决定簇的抗体分子。普通抗血清是含有这些抗体的混合物。而将免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经过克隆化，所产生的抗体是高度纯一的单克隆抗体。
目录 |
B细胞杂交瘤单克隆抗体技术
先将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂的作用下融合。融合后加入含有饲养细胞及次黄嘌呤－氨基蝶呤－胸腺嘧啶核苷(HAT)的选择培基中筛选杂交瘤，测定抗体活性，进行克隆化，筛选出能产生所需特异性和性质的抗体的亚克隆，进行扩增培养或接种于同系小鼠的腹腔中，使其在动物体内增殖，从而能获得大量的单克隆抗体。
骨髓瘤细胞系的选择与培养
目前常用的适于融合的骨髓瘤细胞系多来自BALB/C小鼠和 Lou系大鼠。小鼠骨髓瘤细胞早期是采用缺少 HGPRT或TK酶但可分泌免疫球蛋白(无抗体活性)的骨髓瘤细胞 X63-Ag8细胞株。用X63-Ag8与免疫脾细胞融合形成的杂交瘤细胞，具有能合成两个亲代免疫球蛋白重链和轻链的基因，因而产生特异性抗体机率低。现多采用完全不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞株 （称为不产生者）， 如SP2/O-Ag14、X63-Ag8.653 、FO等细胞系，这样使杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白只含有免疫脾细胞的重链和轻链，从而大大提高了所产生特异性抗体的比率。
骨髓瘤细胞系长期连续培养，可能会产生抗 HAT的变种，即由缺陷HGPRT回复至能产生HGPRT的突变株，以致融合率下降。因此每隔3～6个月将骨髓瘤细胞置于含8-氮杂鸟嘌呤的培养液中培养，以除去回复突变的细胞。必要时对骨髓瘤细胞系进行再克隆，选择质量好的骨髓瘤亚克隆，并深冻一大批以供使用。用于融合的骨髓瘤细胞必须处于活跃的对数生长期。每隔2～3天应换新的培养液继续传代一次，可以使用于融合的骨髓瘤细胞保持在对数生长期一周左右，细胞存活率在90～95％。
免疫的小鼠脾细胞
由于供融合的小鼠骨髓瘤细胞系均来自BALB/C小鼠，故多选用同系BALB/C小鼠进行免疫。以8～12周龄雌性鼠为宜。大鼠可产生大量抗体，融合时亦可选用大鼠作为免疫脾细胞的供体。经特定抗原的免疫，小鼠脾脏中分泌特异性抗体的B细胞数量增加并分化、增殖为浆母细胞，这些细胞易与骨髓瘤细胞融合。
免疫程序与方法各实验室不同，主要依抗原的性质及动物对抗原的免疫应答反应的不同来设计免疫方案。一般说，可溶化蛋白抗原的免疫原性弱，而应用佐剂加强免疫应答反应。初次免疫时将抗原与等量弗罗因德氏完全佐剂混合，腹腔或皮下注射。2～4周后以同量抗原加等量不完全弗罗因德氏佑剂腹腔注射。再过2～6周，在融合前3～4天，腹腔或静脉注射不加佐剂的抗原作为加强免疫。完整的细胞免疫原性强，不需应用佐剂。由于动物对抗原的免疫反应可能有个体差异，最好一次免疫3～5只小鼠，选择免疫反应好的小鼠，取混合脾进行融合，亦可分别取一个小鼠的脾脏分别进行3～5个融合。
融合的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的比例可以是1:1～1:10。但若脾细胞浓度过高，融合后多数培养孔中有多个杂交瘤细胞生长，使克隆化难以进行。一般在微量的多孔培养板中，每孔加入的融合后细胞总数以2×105个为宜，但最高细胞密度不得超过106个/孔。
融合剂
两种细胞间的自发性融合率很低，一般为10-6～10-7。 细胞融合剂聚乙二醇(PEG)可促进细胞融合。作用机理可能为使脂膜易于打开，通常用分子量1000～4000的50％PEG溶液， 在37℃和pH8～8.2，作用1～2分钟效果最佳。有人认为PEG中加二甲亚砜作为融合剂，效果更好。
HAT选择杂交瘤细胞
据报道用108个脾细胞与5×107个骨髓瘤细胞经PEG作用融合后，能存活下来，形成稳定杂交瘤的细胞数只不过100～200个，即以脾细胞计算为1/100万或1/50万，这样培养物中未融合的骨髓瘤细胞的过度生长，将会干扰杂交瘤细胞的生存。为清除未融合的骨髓瘤细胞并且筛选出杂交瘤细胞，现普遍应用HAT选择培养基， 其中含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷。在 HAT培基中小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞死亡，而杂交瘤细胞繁殖形成克隆。骨髓瘤细胞内缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)，不能利用培基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷，所以未融合的骨髓瘤细胞不能繁殖。而小鼠脾细胞虽有HGPRT和TK，但缺乏在组织培基中繁殖的能力，一般在两周内死亡。唯有骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞，可以从小鼠脾细胞中获得HGPRT和(或)TK，在HAT培养基中可通过核酸代谢旁路将次黄嘌呤合成嘌呤核苷酸和(或)将胸腺嘧啶核苷合成嘧啶核苷酸，进而合成DNA。因此杂交瘤细胞能在HAT培养基中繁殖成克隆。
饲养细胞
细胞溶合后，用 HAT培基选择杂交瘤细胞时，由于骨髓瘤细胞和脾细胞大量死亡，单个或少数分散的杂交瘤细胞在低密度时不易存活，必需加入其他活细胞才能使之繁殖，这种被加入的活细胞叫做“饲养细胞”。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾细胞、小鼠或大鼠胸腺细胞、大鼠胚胎传代纤维母细胞或经过γ射线照射的人胚肺纤维母细胞等。通常多采用腹腔巨噬细胞。饲养细胞可与融合细胞同时加到培养孔中，或提前一天加到培养孔中，由不同品系小鼠或异种鼠取得的腹腔巨噬细胞均同样有效。小鼠腹腔巨噬细胞在效能上有差异，最好每次融合也用2～3个以上的小鼠腹腔混合液。
阳性杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后，在HAT培养基中培养 5～14天，即可在培养板孔中生长出杂交瘤细胞集落，此时便可测定抗体活性，对能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，应及早进行克隆化，以防因不产生抗体的杂交瘤细胞过度生长而丢失。另外，开始测定时由于分泌抗体阳性的杂交瘤细胞数尚少，可能测得抗体阴性，因此应重复测定抗体活性2～3次，并在换液后3～4天进行，以便抗体积累。为尽早筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，需要用敏感、可靠、快速的方法测定，常用的有固相放射免疫测定法（RIA），酶免疫分析法(EIA)和免疫荧光法(IFA)等来检测上清中的微量抗体。
①固相放射免疫测定法：原理是抗原结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。若待测标本中存在对此抗原的特异性抗体，就会同吸附在载体表面的抗原结合，然后与放射性核素125Ⅰ标记的第二抗体一起孵温育，即可根据放射性强度，判读有无相应抗体的存在。本法敏感、简便、准确，是目前筛选杂交瘤抗体最常用的方法。②酶免疫分析法:常用的是间接法，原理是用酶标记的第二抗体筛选杂交瘤培养物上清中与抗原结合的抗体。此法的灵敏度和特异性与放射免疫测定法相似，但更简便、快速，显色反应可用肉眼鉴别，且酶标试剂比较稳定，是常用于初筛的方法。其缺点是某些细胞内有内源酶（如过氧化物酶），造成阴性对照本底较高，影响结果的判读。此外，用该法不易查到对一小群细胞（细胞亚群）起反应的抗体，此时可能将这种弱反映误认为本底而漏掉。③免疫荧光法：采用荧光色素标记第二抗体，用间接免疫荧光染色法检测活细胞膜表面抗原的抗体。本法已广泛用于杂交瘤上清的筛选，能敏感地检出抗细胞亚群表面抗原的抗体。免疫荧光法的全过程可在96孔聚乙烯微量板中进行，结合运用荧光激活细胞分类仪(FACS)分离荧光染色阳性和荧光染色阴性的细胞。本法是大量、快速筛选分泌抗体的杂交瘤的有效方法，但因价格昂贵而不易推广。
杂交瘤细胞的克隆化
对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化，是获得纯的克隆系的一个重要步骤。克隆化时应注意：①融合后，一旦抗体检测阳性，应立即进行克隆化，同时双份传代，液氮冻存。②融合后，待骨髓瘤细胞确已死亡，可将 HAT培养液换以HT培养液，初次克隆化时加HT。③应用有限稀释法进行克隆化时必须经过多次克隆（至少两次以上），才能基本保证杂交瘤细胞为单克隆。④克隆化后的杂交瘤细胞，在培养过程中有时也会发生变异或染色体丢失，失去产生特异性抗体的能力，因此需定期测定培养上清中抗体的滴度。若抗体滴度下降或转阴性时，则应复苏原始冻存的细胞管，进行培养检测，必要时应再克隆化和再冻存。
克隆化的方法为:①有限稀释法。本法简便易行，不需特殊设备，克隆效应高，故最常用。方法是将测得抗体阳性的杂交瘤细胞作连续稀释，稀释至每毫升含10个细胞或更少，按定量分种于含有饲养细胞层的96孔培养板中，直接观察孔里是否仅有一个细胞集落生长。在初次克隆化时，有的生长孔中只有一小部分有抗体活性，故应将阳性克隆细胞移至24孔培养板扩大培养，并冻存一部分细胞，及时进行再克隆，以提高抗体阳性克隆的百分率和保证杂交瘤细胞的单克隆化。②软琼脂培养法。将适当浓度的杂交瘤细胞加至软琼脂培养基中，使由一个细胞增殖的克隆形成一个集落，将细胞集落扩大增殖培养，测定上清液的抗体活力，若为阳性就可选出所需抗体的克隆。本法的优点是细胞融合后可直接进行克隆化，其缺点是克隆阳性率低，克隆化所需细胞浓度较高，因此所得单个细胞集落并不能绝对代表单个细胞克隆，常需进行再克隆化。
杂交瘤细胞的增殖
一旦杂交瘤细胞成功地克隆化，就可进行大量增殖以产生抗体。其方法有：①体外扩大培养法。刚获得的杂交瘤细胞系不能耐受稀释，因此培养物应逐渐扩大。先将96孔培养板中抗体阳性的细胞作1:3或1:5稀释，移至24孔培养板中孵育，再将其中抗体阳性的细胞扩大到25cm2培养瓶，然后转种至75cm2的大培养瓶中大量增殖，一般细胞培养上清的抗体含量可达5～50μg/ml。②动物接种。将杂交瘤细胞接种于同系小鼠皮下或腹腔内，约10天后，分别自血清或腹水中获取较大量的抗体。
杂交瘤细胞的保存与复苏
在杂交瘤培养过程中应尽早地将抗体阳性的杂交瘤细胞冻存起来，放入液氮中(-196℃)保存，以防因体外传代培养的细胞突变或因污染而丢失。
细胞复苏的方法是：从液氮中取出细胞管，立即放在37℃水浴中化冻，并立即用毛细吸管吸出细胞。放入培养液中离心，将沉淀的细胞悬于培养液中培养。
单克隆抗体的提纯
单克隆抗体的保存
由腹水中获得的抗体，经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心，取上清液加0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融，否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体，冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定， 培养上清加0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
单克隆抗体在临床上的应用
单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究较多的是抗人 T细胞单克隆抗体，用以识别人T细胞表面的不同抗原决定簇，有OKT系统及Leu系统。T细胞，特别是免疫调节T细胞（Ti/h及Tc/s细胞）对于调控免疫应答和维持免疫自稳起着至关重要的作用，临床上许多疾病的发生与免疫调节失常有关，因此，研究 T细胞在这些疾病中的变化，有助于探讨病因和辅助诊断。各种免疫缺损病、肿瘤或感染性疾病都与免疫功能低下有关，而变态反应性疾病、自身免疫性疾病等与免疫功能亢进有关。因此应用 OKT系列单克隆抗体检测这些疾病患者外周血中T细胞亚群及T4/T8比值的变化，对探讨发病机理，及时诊断疾病及监测病情发展有十分重要的意义。接受肾移植或骨髓移植的患者往往需应用各种免疫抑制剂以控制排斥反应， T细胞亚群的检测有助于了解移植器官的排异和发展。
抗人 T细胞单克隆抗体可用以治疗白血病、移植物抗宿主反应(GVHD)和急性肾排斥等，目前尚处于摸索阶段。
| 关于“单克隆抗体技术”的留言： |  订阅讨论RSS
|
|
目前暂无留言 | |
| 添加留言 | |