临床生物化学/血浆蛋白质的检测及其临床应用

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临床生物化学

蛋白质与临床诊断
- 健康与疾病时的血浆蛋白质
  - 血浆蛋白质的理化性质、功能与临床意义
  - 关于血浆蛋白质的正常参考值
  - 疾病时血浆蛋白质变化的图谱特征
  - 血浆蛋白质的检测及其临床应用

血浆蛋白质的检测及其临床应用可以概括为以下几方面：

2．通过电泳将血浆（或血清）蛋白质初步分离，可以半定量地检测主要蛋白质的组分及其图谱，如Alb、α₁、α₂、β₁、β₂、γ等区带，并以相对百分比表示之。

3 ．特异的定量测定个别蛋白质，多采用免疫化学的技术，通过制备特异的抗血清（或抗体）测定抗原-抗体复合物。依据抗原抗体结合及其复合物的检测手段可有浊度亮度法、沉淀法、免疫扩散法、免疫电泳法等。如果含量很微的蛋白质则采用放射免疫测定法（RIA）及酶免疫测定法（EIA）。

此处仅从临床的需要，对方法学的临床应用及其进展作一简介。

（一）血清总蛋白质的测定

新鲜全血采取后经自然凝固，析出血清，除去含量约为2-4μg/L的纤维蛋白原，剩下的即为血清蛋白质。健康成人在活动状态采血，其含量为63-83g/L，平卧休息时为60-78g/L。血浆总蛋白质含量的变化不外两大原因；一是血容量的改变（浓缩或稀释）；二是个别蛋白质组分的明显增加或减少。血浓缩时的高血浆蛋白血症，各个组分成比例的增加（病史中有失水史）。血稀释时的低血浆蛋白血症亦是相对的，各组分蛋白质仍保持正常的比例。

由于个别蛋白质的变化所致的低蛋白血症，最多见的原因是低血浆白蛋白。轻度的高蛋白血症可由于慢性感染性疾病引起的多克隆，弥散性的γ球蛋白增多症是由于多发性骨髓瘤或异常蛋白血症时单克隆免疫球蛋白增多。

应当指出，在进行化学定量测定血浆蛋白质时，我们作了如下假定：①所有血浆蛋白是纯的多肽链（糖脂类和金属有机物等均不计在内），其含氮量平均为16%；②几百种血浆蛋白其理化性质虽不同，但与化学试剂作用产生的反应（如呈色、沉淀）是一致的。显然，这是过于理想化了的，事实上前一种情况是不存在的，后一种情况在不同蛋白质之间也有很大的差别，因此采用任何一种化学方法作血浆蛋白质的测定，严格来讲都是从实用出发的，是相对的定量。

至今，凯氏定氮法仍然是建立各个具体方法时采用的参考标准方法。

双缩脲比色法是目前首先推荐的蛋白质定量方法。方法操作简便，虽然双缩脲试剂有大同不异。其中酒石酸钾纳可以稳定在碱性溶液中的铜离子，含有碘化物作为抗氧化剂。双缩脲反应生成的复合物其吸收峰为540nm。可采用公认的标准牛血清白蛋白作为标准品，经精确称量，必要时用凯氏定氮法标定。各地质控中心提供的混合标准血清可作为第二参考，血清用量100μl，在10-120g/L浓度范围内呈良好线性关系，批内CV值<2%，其它常用的方法还有：

1．基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚试剂比色法由于各种蛋白质分子中上述两种氨基酸的组成比例不同，特别是白蛋白含色氨酸为0.2%，而γ-球蛋白中含量达2%-3%，导致较大的差异。Lowry的改良法在酚试剂中加入Cu²⁺，集中原法和双缩脲反应两者的作用，使呈色灵敏度提高。其中75%的呈色依赖于Cu²⁺。反应产物最佳吸收峰在650-750nm，方法灵敏度为双缩脲方法的100倍左右。有利于检测较微量的蛋白质。但试剂反应仍易受多种化合物的干扰。

2．采用280nm和215/225紫外吸收值，计算蛋白质含量　280nm 是由于蛋白质分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特异性和准确性受蛋白分子中该种氨基酸的含量比例影响甚大。尿酸和肝红素在280nm附近有干扰。紫外区200-225nm是肽健的强吸收峰。在此区域其吸收值为280nm的10-30倍，将血清稀释1000-2000倍可以消除干扰物质的影响。

3．采用沉淀反应进行散射比浊法　用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚为简便，不需特殊仪器，技术关键在于：①选择最佳试剂浓度及温度；②混匀技术；③选用的标准；④待测标本中的蛋白浓度。

4．染料结合法蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑（amino black）与考马亮蓝（comassive brilliant blue ）。这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。

关于用化学方法测定白蛋白，现多采用特异性的染料（BCG或BCP）结合法，已于第一节中介绍。

（二）血清蛋白质的电泳分析

醋酸纤维薄膜（ACM）和琼脂糖凝胶是目前最广泛采用的两类介质。巴比妥缓冲液pH8.6，离子强度0.05，标本用量3-5μl，标准电泳条件为CAM每厘米宽电流0.75mA，琼脂糖约为每厘米宽10mA，电泳时间40-60分钟，电泳前沿达6cm左右。虽然目前已开展和应用不少个别蛋白质的测定方法，但血浆蛋白质电泳图谱至今仍然是了解血浆蛋白质全貌的有价值的方法，可用为初筛试验，以提供较全面的信息。正常血清电泳后可以很好地分为5条区带（Alb、α₁、α₂、β₁、β₂），新鲜标本可以分出β带（以C₃成分为主）。由于各条区带中各个蛋白质组分的重叠、覆盖（如CER常被α₂MG及Hp所掩盖），以及某些蛋白质染色带很浅（如脂蛋白和α₁糖蛋白），可以用其它染色方法辅助。目前除了常使用的氨基黑和丽春红染料外，还采用灵敏度更高的考马亮蓝。

用血清蛋白质电泳测定各组分的含量，通常可采用各区带的浓度百分比（%）或绝对浓度（g/L）表示之。

用醋酸纤维薄膜电泳测得正常小儿及成人血清蛋白质的参考值可参见表2-7。

在疾病情况下血清蛋白质可以出现多种变化。根据它们在血清蛋白质电泳图谱上的异常特征，不少学者曾试将其分为以下类型，参见表2-8及图2-1。

表2-7 各年龄组血清蛋白质电泳正常值（X±SD）范围

年龄	总蛋白质（g/L）	蛋白质各组分的浓度比（%）
白蛋白	总蛋白质（g/L）	α₁	α₂	β	γ
脐带血	57	69.4	2.5	5.4	7.0	15.4
	±12	±5.6	±1.0	±1.6	±2.4	±4.4
新生儿	60	64．2	3．5	14．1	9．2	6．2
	±12	±13.2	±3.6	±2.1	±2.4	±4.8
1-5岁	68	65.2	3.1	11.2	10.2	10.4
	±11	±7.8	±1.3	±2.7	±2.6	±5.5
6-12岁	69	61.7	3.0	10.5	10.2	14.7
	±14	±6.1	±1.8	±3.4	±2.0	±5.8
成人^△1		64	2.8	6.6	7.2	14.4
		45-78	0.8-6.2	3.4-12	4.8-14	7.0-25
2		64	2.8	5.9	9.8	17.5
		55-71	0.9-4.8	2.6-9.2	6.3-13.3	12.2-22.3
3		68.7	3.1	6.0	8.2	13.8
		53-76.6	1.3-5.0	2.7-9.9	5.5-14.9	8.8-21.3
4		62.2	4.2	6.6	10.2	17.33
		47-77	0.7-7.6	2.4-10.8	4-16.4	8.8-25.7
5		65.7	2.28	5.7	8.8	17.5
		58.8-72.7	0.7-3.8	3.6-7.8	6.3-11.3	12.3-22.7

△资料取自不同作者：①上海医科大学n=50；②重庆医科大学n=123；③同济医科大学n=132；④苏州医学院n=100；⑤湖南医科大学n=100

表2-8　异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征

血清蛋白质的图谱类型	总蛋白质	Alb	α₁	α₂		β		γ
1.低蛋白血症	↓↓	↓↓	N↑	N		↓		N↑
2.肾病型	↓↓	↓↓	↑	↑↑				不定
3.肝硬化型	↓N↑	↓↓	N↓	N↓				β-γ↑（融合）
4．急性炎症或急性时相反应症	N	↓N	↑	↑				N
5.慢性炎症型		↓	↑	↑				↑
6.弥漫性肝损害型	↓N	↓↓	↑↓					↑
7．弥漫宽γ球蛋白血症型	↑	↓N						↑↑
8.M蛋白血症型		在α-γ区带中出现M蛋白峰-M区带峰
9．高α₂（β）-球蛋白血症		↓			↑↑		↑
10.妊娠型（高α型）	↓N	↓	↑				↑	N
11.蛋白质缺陷型		个别区带出现特征性缺乏

上述电泳图谱分型有助于临床疾病判断的参考。在某些蛋白质异常增多的情况下，可出现异常区带。如高浓度的αFP可以在Alb与α₁区带间出现一条清晰的新带（有人称之为肝癌型）；CRP异常增高可出现特殊界限的γ区带；单核细胞白血病可出现由于溶菌酶异常增多的γ后区带等；单克隆免疫球蛋白异常症（M蛋白血症）则在α-γ区带中出现一条很深的界限截然的M区带。

在大剂量使用青霉素或水杨酸等药物时，由于药物与白蛋白的结合，可导致这部分白蛋白电泳迁移率的加快而出现区带状的改变。

急性时相反应型常以α₁及α₂区带加深为特征；妊娠型以α₁区带增高为特征，伴有β区带的增高；以α₂区带增高为特征的图谱常见于风湿病等免疫反应性疾病。其它慢性炎症则同时有α₁、α₂及γ-球蛋白的增加。在肝硬化及慢性肝炎伴肝硬化及慢性肝炎伴肝硬化可以出现β、γ区带融合弥散的宽γ带。慢性迁延型肝炎、慢性活动型肝炎及慢性反复感染可以出现多条γ区带的加深。

（三）免疫化学法测定个别蛋白质

散射比浊法和透射比浊法由于测定方法简便、快速而被广泛使用。许多试剂盒供应抗血清及标准蛋白质，即可建立此测定法。此技术可以测定抗原-抗体复合物（沉淀颗粒）形成的量（终点法），亦可采用测定复合物形成的速率（动力学方法，即通过散射浊度计测定抗原-抗体混合反应复合物颗粒形成的时间，即反应速率。一定条件下，反应速率与反应体系中抗原的含量直线相关，可以通过制备标准曲线而计算）。

现已有设计完善的带微电脑进行数据处理的散射浊度计和透射浊度计，以免疫化学系统（immuno-chemicalsystem,ICs ）可供应。免疫扩散法不需昂贵设备，放射免疫法则需要液体闪烁计数器及应用放射性同位素。

现将几种常用的免疫化学测定法的特点列表总结比较于表2-9、10中。

表2-9　电泳与免疫化学检测血清蛋白列表比较

电泳法（CAM法）	各种免疫化学分析法
前白蛋白	前白蛋白
白蛋白	白蛋白
α₁球蛋白（区带）	α₁抗胰蛋白酶
	α₁酸性糖蛋白
	α₁脂球蛋白
	α₁脂蛋白
	甲状腺激素结合球蛋白，皮质醇结合蛋白
α₂球蛋白（区带）	结合珠蛋白
	α₂巨球蛋白
	铜蓝蛋白
	前β脂蛋白
β球蛋白（区带）	转铁蛋白
	血红素结合蛋白
	补体C₄，C₃
	β₂微球蛋白
γ球蛋白（区带）	IgG，A，M，D，E
	C反应球蛋白

表2-10　几种免疫化学测定方法的比较

灵敏度	准确性	检测时间
散射比浊法　10mg/L	批内CV值<5%	几分钟（动力学法）
		1小时　（终点法）
透射比浊法　20-30mg/L	批内CV值5%-10%	1小时内
免疫扩散法　>20mg/L	批间CV值5%-15%	1-2天
放射免疫法 μg/L	批内CV值5%-10%	几小时

关于免疫化学测定方法中的标准品和方法的标准化问题：含有准确含量的纯抗原蛋白不易买到。制备的抗血清由于其来源不同，其特异性和灵敏度效价有很大差异，一个纯蛋白制剂来制备高特异性的抗血清亦非轻易之举。因此抗血清的制备和方法的标准化是方法推广和使用的关键。据美国病理学会的研究报告，测α₁AT用同一标本，使用5种不同的方法在510个实验室报告的结果从1.6-2.34g/L。同一研究中C₃补体的测定采用了8种不同方法，测定结果为149-282mg/L。

世界卫生组织目前提供以下参考标准品：IgG 、IgA、IgM、IgD、IgE、αFP、CEA、Alb、C₃、CER及TRP。使用国际单位（IU），没有使用绝对的质量单位。美国疾病控制中心（CDC）供应的国家参考标准品人血清蛋白质含13种蛋白质，亦使用WHO的国际单位标明含量。

由于不易获得稳定的抗血清和标准化的参考蛋白质，各个实验室还不得不根据自己的条件建立自己的正常参考值。