多肽合成仪
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一、基本概念 1.多肽 是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。 2.多肽合成 是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。多肽合成总的来说分成两种：固相合成和液相多肽合成。 3.多肽合成仪 多肽合成是一个以树脂（人工合成的固相介质）为载体，在一定的反应条件下重复添加氨基酸，经过化学反应后合成多肽的过程，多肽合成仪即是用来合成多肽的仪器。一般情况下，多肽合成仪整体由主体、传输设备、动力装置以及软件系统组成。
二、历史背景 1． 固相合成法的诞生 多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。 到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。 1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)。因此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。 1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。
2． 多肽合成仪的诞生 虽然Merrifield在发明固相多肽合成科学并取得巨大成功的同时，使用了自主研发的合成设备，但却没因此将多肽合成仪引入市场。1970年，Beckman公司开发的全自动多肽合成仪Beckman 990 Peptide Synthesizer 作为第一台投入市场的科研用多肽合成仪，被美国多所大学的实验室采用。 几乎同一时间，Vega Biotechnologies, Inc.公司开发出两款经济型多肽合成仪：Vega’s Coupler 1000与Vega’s Coupler 250 (不久又推出Vega’s Coupler 296),其将多肽合成后续的在线切割理念结合到设备中，所有反应器采用防爆玻璃材质，防止TFA的腐蚀。被当时的肽化学界称为最经济适用的多肽合成仪。 而今，Beckman与Vega’s两家公司均停止的多肽合成仪的研发与制造，而转向到更多面的化学合成、分离、检测技术设备的研制产业中。
3． 多肽合成仪的发展 a) 第一代多肽合成仪
第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代。
虽然随着生产工艺的改进和发展，如今第一代多肽合成仪已全部退出了市场。但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而来，第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义。
b) 第二代多肽合成仪
第二代多肽合成仪是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90为代表的，诞生在上世纪八十年代。此两款设备也是目前市场上仍在销售的最早的多肽合成仪。 PS3 的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但反应相对温和：1）有时候多肽-固相载体在静电作用下会“抱团”，使其不能与液相充分混合，在这种情况下需要调高氮气的压力以消除静电作用；而在静电作用消除后要把压力立刻调低，不然的话较高的压力会把多肽-固相载体“吹”到反应器液面上方。由于多肽-固相载体具有较强的粘壁性，一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来，也就是无法再参加反应。显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的，这就是造成反应“死角”的重要原因。反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度，有的甚至造成合成的失败。2）长时间氮气鼓泡会使溶液挥发，液面降低后一部分多肽-固相载体就粘在液面上方，也无法再参加反应。3）氮气消耗量大，运行成本增大。 ACT90的设计原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。ACT的多肽合成仪同样具有反应温和的特点，即转动角度与速度都不能够完全达到氨基酸耦合的极限，反应往往需要更长的时间。
c) 第三代多肽合成仪
第三代多肽合成仪是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 与C S Bio公司的CS336为代表的无死角多肽合成仪为代表的，诞生在上世纪九十年代。 ABI433的设计原理是反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的最上方。换句话说，溶液可以达到反应器内部的任意点，真正做到了无死角。由于搅拌速率可达每分钟1800转的高速，反应得以充分完全。由于无死角的搅拌方式保证的肽的合成纯度，ABI433型多肽合成仪（其退出多肽合成仪市场后最后一款仪器）至今在世界上还占有着很大的比例。当然，ABI产品的售价也是最高的。由于部件使用频率高，电磁阀会经常损坏，而ABI将7个电磁阀做成模块化的设计，坏掉一个电磁阀必须要更换整个模块，无形中增加了维修成本。 CS336的设计原理是反应器中点为圆心，上下做180度旋转搅拌，搅拌速度可达180rpm，同时其采用了氮气鼓泡反应方式的优越性，将氮气吹动作为可选反应方式融入反应方法中，多肽合成仪在科研领域的高耦合率效果得到充分体现。
4． 多肽合成仪的现状 进入二十世纪以来，各大合成仪制造公司相继推出了升级产品和新产品，如Protein Technologies公司推出Tribute双通道多肽合成仪，将“短信通知”功能融入产品，增添了用户与设备之间的紧密感，更加人性化；C S Bio公司对其从研发型到生产型设备的UV Online Monitor系统配置统一升级，用户可直观看到每一部氨基酸偶联反应的状态并可根据数据调整出最佳合成效果与工艺；Advanced ChemTech公司自2005年破产重组后分裂为两家新公司，其中Aapptec延续了其前身的生产步骤，推出Focus XC三通道合成仪。美国另一家公司CEM以蛋白质有机反应设备的制造著称，推出了微波多肽合成仪同样可以合成简单的小分子多肽。其采用微波加热方式，大大提高了反应速度，将反应的速率增加到之前多肽合成仪的几倍甚至十几倍。可惜的是在加热的情况下副反应也相应增多，多肽纯度不能与之前的第三代甚至第二代产品媲美。另外，微波加热方法无法放大，故不适合用作多肽药物的研发。
三、功能研究 1． 运行原理 多肽合成仪以固相合成为反应原理，在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序（序列，一般从C端-羧基端 向 N端-氨基端）不断添加、反应、合成，操作最终得到多肽载体。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，但对于某些短肽，tBoc因其产率高的优势仍然被很多企业所采用。
具体合成由下列几个循环组成：
1） 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去 除氨基的保护基团。 2） 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。 3） 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。
2． 基本元件 a) 反应器 Reaction Vessel 数百年来，制药业的反应器/反应釜 设备以玻璃材质最为常见，因其完全透明且耐腐蚀，而被众多化学、生物学专家沿用。多肽合成的过程需要操作人员直观监测，同时合成后可进行在线切割（切割试剂TFA的强腐蚀性对反应器材质有了极大限制），这些要求限制反应器以玻璃材质最为适用。 而玻璃材质的反应器在制造工艺上有极大的难度限制：①烧制工艺：磨口精度要求极高，正如很多国产设备都无法达到要求出现漏液漏气现象，玻璃壁均匀程度等。②配合搅拌柄以及密封装置的成套加工工艺③防爆处理 b) 氨基酸储罐 Amino Acid Reservoirs c) 溶剂储罐 Solvent Reservoirs d) 量筒 Metering Vessel e) 转液瓶 Transfer Vessel f) 感应器 Sensor 多端触发器自感应定量量取法，直观、科学、相对误差最低。 g) 废液桶 Waste Carboy 废液桶通常选择容积较大的HDPE桶，保证通风良好，同时需安装感应器装置时刻检测废液情况，避免溢出。 3． 控制配件 a) 电磁阀 Valves 多肽合成仪中的电磁阀属于敏感配件，其控制液路的串联与闭路，在氨基酸转移与量取，溶剂转移与量取两步骤中起到至关重要的作用。不同品牌的合成仪对电磁阀的设计与排布也略有不同。如PTI合成仪中，电磁阀成矩阵式排列，便于观察，但若发生堵塞情况则又有维修的不便，一个电磁阀堵塞则可能造成整块矩阵式电磁阀全部更换；CSBio合成仪中电磁阀采取Normally Close 方式，在非溶液转移操作过程中，电磁阀闭合，减少了污染与堵塞的发生，整体呈管路式排布；ABI433合成仪的电磁阀为7位组合，万一出现堵塞情况则整组更换，查找检修时非常方便，但成本也相对高了6倍。 b) 控制面板 Control Box 控制面板内往往含有光敏组建，部分控制电磁阀以及感应器控制组。与电脑主机的控制系统、合成仪统一的链接在一起，完成多肽合成的全过程。 c) 软件系统 Operating Software 多肽合成仪的操作软件。不同品牌合成仪所注册的软件也不同。
4． 检测方法 a) UV Monitor 在多肽合成仪中，在线检测耦合效果的装置，如UV Monitor往往是选配装置，客户可根据实验的需要选购。其功能是让操作者直观的看到多肽合成的每一部氨基酸偶联效果，从而针对特定的序列做合成设置的调整，最终达到最佳合成效果。 对于不熟悉多肽合成仪操作的用户来说，UV Monitor是相当重要的。
b) 试剂检测：没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户，也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。 Kaiser试剂包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液 配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。 c) 其它检测游离氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。
四、专利文件 对于大学、实验室等科研用户以及需要申报新药的生产企业来讲，使用的合成设备的国际专利号以及规定内容是非常有用的信息。 ACT多肽合成仪专利：United States Patent 4746490 Activotec合成应用技术专利： IPC8 Class: AC07K104FI USPC Class: 525 5411 CEM合成技术专利：US 7,582,728 C S Bio多肽合成仪专利：US Patent 5,380,495 & 5,453,487. C S Bio多肽合成仪反应器专利：US Patent 6320025 PTI多肽合成仪设备专利： U.S. Patent No. 5,203,368 (Symphony). No. 5,064,940 (PS3). PTI多肽合成仪反应器专利：U.S. Patent No. 5,980,839. Shimadzu多肽合成仪专利：United States Patent 5344613
五、选购指南 1． 科研单位考虑因素 a) 设备本身对实验研究的帮助 ①对于多肽合成化学反应，使用设备可避免人手工操作对人体的伤害(试剂腐蚀) ②由于程序化设定，可保证每步骤偶合反应的充分性以及实验整体的稳定性 ③可以合成难肽以及超长肽(可提供其使用研究型多肽合成仪合成多肽的检测报告) ④在休息时间可以不间断合成工作 研究型多肽合成仪需满足循环式氨基酸添加位置多于20个，在夜间以及周末，预先配好的保护氨基酸可根据程序设置自动偶联并替换新的位置，保证了实验的效率，完全实现全自动！ ⑤即使实验进行了很多年，更换了很多研究人员，实验数据还可以保存在电脑中。 b) 国际国内相关研究人员使用该多肽合成仪进行的有效研究结果 多肽合成仪的制造商应提供其公开发表的研究性论文多篇。 为进行多肽合成实验的学生们提供研究数据并使其模拟合成过程，更好的体验机械操作多肽合成的全步骤，检测自己的合成结果。 c) 多肽合成仪设备的专利保护对今后研究结果的影响 考虑到高等院校实验研究的严密性，结合对后期研发成果的保护机制，通常采购的设备需要具有其国际专利许可，以确保实验研究项目的顺利申报。 d) 制造商的生产规模 制造商的品牌、生产规模以及其所拥有的生产资格认证，都从侧面反映了其供应设备的质量、信誉以及对客户的服务保证。
2． 生产企业考虑因素 参考科研单位选购小型设备的考虑因素，对于生产型企业，使用不同品牌的多肽合成仪往往还应考虑其连贯完整的设备生产线，从小型合成规模至生产型合成规模的各种设备齐全。通常大型设备可根据反应器大小判断其合成规模，通常可在线切割的玻璃材质反应器/反应釜需达100L，可保证批量产数十公斤的多肽产品。
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