临床生物化学/影响光谱分析的主要因素

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临床生物化学

常用分析技术在临床生物化学中的应用
- 光谱分析技术的应用
  - 光谱分析技术的分类
  - 光谱分析的常用方法
  - 影响光谱分析的主要因素

临床生物化学目录

光谱分析的基础是被测物质的浓度与吸亮度成正比，但在实际测定中，往往容易发生偏离直线的现象而引入误差，导致误差的主要原因有化学因素、主观因素和光学因素等三类。

（一）化学因素

化学因素是指被测溶液不遵守光吸收定律所引起的误差。主要有以下几种影响。

1、被测物浓度的影响由于有色物质的电离、水解、缔合等原因，当溶液稀释或增浓时，有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高，因而也就不完全符合光吸收定律。

2、溶液pH的影响有些溶液的颜色对pH值的改变十分敏感，因而溶液pH不同时常会产生误差，如溴甲酚绿法测定血清白蛋白。

3、杂质的影响如被测物溶液中含有杂质而且这种杂质本身是有色的，或能和显色剂生成有色化合物或沉淀，或能与被测物质发生化学反应等，都会影响吸光度的变化。

4、放置时间的影响某些有色物质能迅速生成，但却不太稳定，放置后色泽消退或起变化，而另一些有色物质须经过相当长的时间后，反应才能完全，因此，若在不恰当的时间内进行比色，将会造成相当大的误差。

此外，还有溶剂、温度、溶液体系的均匀性等都会引起测定的误差。

（二）主观因素

由于操作不当，特别是在分离、稀释和加显色剂等过程中，没有遵守一定的条件，也会引入不同程度的误差。因为有些有色物质的生成和其颜色的深浅，往往随加入试剂的量、加入顺序、试剂浓度、反应温度和反应时间等因素而发生改变。

（三）光学因素

光学因素主要是指分析仪器的性能低劣所引起的误差，分析仪器应用最多的是分光光度计，它们的性能好坏直接影响到测定结果的可靠性和精密性。因此对分析仪器均应有质量保证措施，这里主要介绍分光光度的质量保证方法。

1、分光光度计的性能检查

（1）波长校正：使用光电比色计或分光光度计，在更换光源灯、重新安装、搬运或检修后，以及仪器工作不正常时，都要进行波长校正。就是正常工作的仪器，每隔一个月也要检查一次波长，必要时进行校正，这样才能保证波长读数与通过样品的波长符合，保证仪器的最大灵敏度。方法常用谱钕滤光片校正法，适用于721型仪可见光区的波长校正，常以585nm或529nm处的吸收峰或T%为标准。鉴于721型仪器的出射光波长较宽，不易将573nm和585nm的两峰或两谷分开，校正时易产生误差，故推荐用529nm处的峰或谷为标准来进行波长校正。校正时，将仪器按要求预热。要求电源电压稳定。波长度盘置580nm处，T%调至最大，在比色杯处放一白纸条，观察是否有光强均匀、边缘无光晕或杂光的光斑，如不符合要求，可调节灯泡位置使其符合要求，是为波长校正的粗调。再把灵敏度扭置于“1”（最低档），波长度盘对准529nm，电表机械零点为零，在光路空白时调T%为100%T，并反复查零点和100%T稳定情况。将谱钕滤光片插入光路，慢慢旋转波长度盘，找到透光率最低的一点（向左右微旋波长度盘时，该点透光率值均增加），这一点即为波长529nm。检查波长度盘的指示值是不是529nm，如指示值为534nm，此时波长工误差为5nm，超出规定（±1nm）必须进行调整。

调整方法：将波长度盘对准529nm，从光路取出谱钕滤光片，光路空白时调电表指针到100%T，再将谱钕滤光片插入光路。打开仪器左侧小盖板，找到波长校正螺丝（3个中左侧柄长的一个）；反时针方向微微调节（负误差时顺时针方向），使电表指针的指示T%为最低。反复检查波长误差情况，直到符合仪器技术指标为止。盖好左侧小盖板，校正结束。

有些高档仪器如岛津UV-260型双光束分光光度计，可使用氢灯或置谱钕滤光片于测定比色槽内，编入滤工扫描程序后，仪器即可自动地在一定波长范围内进行波长校正。高档分光光度仪的光学系统密封在一个单元组件内，若发生故障，波长不准，常须请制造商派专人修理。其它尚有谱线校正法、干涉滤光片校正法和有色溶液校正法等，可参考有关资料。

（2）线性检查：线性检查包括仪器线性及测定方法线性两个方面的检查。线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。这种偏离，按比耳定律的现象来自两个方面：一是溶液本身不符合比耳定律，这种现象叫做化学偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度测定值与浓度之间不成线性关系，这种现象叫仪器偏离。此处研究的是后者。仪器偏离的因素很多，如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。

仪器线性检查常用一种在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比耳定律的有色物质，配成不同浓度的溶液，来检查仪器本身是否能如实地反映有色物质的浓度变化。这种检查方法与任何被测物质呈色反应等方法学上的问题无关。用测得的吸光度对浓度作图，在理想情况下应是一条直线。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文蓝浓度系列来检查，波长用610nm。

（3）杂光（散光）检查：在吸光度测定中，凡检测器感受到的不需要的辐射都称为杂光。杂光对吸光度测定法的准确性有严重的影响，但却往往被忽视。杂光的来源有：①仪器本身的原因，如单色器的设计、光源的光谱分布、光学原件的老化程度、波带宽度以及仪器内部的反射及散射等；②室内光线过强而漏入仪器，仪器暗室盖不严；③样品本身的原因，如样品有无荧光、样品的散射能力强弱等。

杂光检测方法：①紫外光区的杂光监测可用10±0.1g/L的碘化钠溶液，在240nm处测定的吸光度应大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化钾溶液，在220nm处测其透光度，即为杂光量，一般应小于1%T。以上测定均用石英杯，以蒸馏水校零。②在可见光区可使用谱钕滤光片或硫酸镍法检查。先用谱钕滤片校正波长，然后用黑纸片挡住比色杯光路（进口仪器带有比色杯样黑色标柱）之后调整0%T，再用空气做空白调100%T。插入谱钕滤光片，在585nm处测定，其测定值即为杂光水平。

（4）比色杯的质量检查：比色杯一般由玻璃、石英或荧石制成，光径1.0或0.5cm,光线通过时有一部分光为空气与玻璃接触面的反射而损失（4%），另一部分（很少）为玻璃吸收。比色杯的质量除其原料外，再就是玻璃的厚度均匀，上下一致，各杯彼此相配。厂家多以四个套供应，且杯口上部外面标有箭头，箭头对光源侧使用。尽管如此，在使用前还是应作质量检查。常用伊文蓝法：将一定量的2.0mg/L的伊文蓝溶液注入比色杯中，比色杯内液面应相等。用一个比色杯作标准，用红色滤光片（波长600～610nm），用水校零后将此杯的读数准确调至50%T，接着读取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范围内者为合格。

（5）稳定性检查：检查方法：将分光光度计及附件接于0.5kVA以上的可调变压器，先调电压为220V，波长固定在650nm，在光路比色杯装以空白液，调读数为90%T处，再将电压升至230V及降至190V，观察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之间为合格。在电源电压不变的条件下，在3分钟内其读数漂移不应超过标尺上限值的±0.5%。

（6）重复性检查：在波长、工作状态、电源电压、比色杯配套等合格的前提下，进行重复检查。在用交流电源供电时，仪器对一种溶液重复测定的读数值差应小于或等于标尺上限值的1%。试验方法：将分析纯重络酸钾于120～150摄氏度烘干2小时，干燥器中冷却。精称509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸馏水溶解并加至刻度，混匀（此液180mg/L铬）。就用液为30、60、180mg铬/L。取波长440nm，将应用液各浓度管连续测3～5次，各浓度管中最大误差小于1%T为合格。

（7）灵敏度检查：将重铬酸钾液配制成30和32.5mg铬/L及120和122.5mg/L铬的4种应用液（浓度差两组各为2.5mg/L铬）。波长440nm，以水校零点，将上述应用液连续测3次吸光度，两组2.5mg/L铬浓度差的吸光度值差都不小于0.01为合格。

2、分光光度计日常工作状态监测在可见光区范围内，用一种有色溶液检查仪器是否处于较好的工作状态（包括波长、杂光水平等），常用硫酸镍水溶液。该液在400～700nm之间有吸收峰，峰值在510nm。检查时，在400、460、510、550及570nm处测定硫酸镍溶液的透光度值，记录并保存。待一定时间后用该溶液再检测。比较前后两次的数据，即可知仪器的工作状态。

硫酸镍溶液的制备：将硫酸镍溶于0.1%的硫酸中，用量的多少以在510nm测得的透光度达80%T为准，以0.1%硫酸校零点，配好后密封备用。

监测的意义：在400、700nm处的测定可以监测杂光，这些波长处的测定值升高说明杂光增加，其中任一值增加3%就需要进行检修。510nm处的测定值可以监测带宽，这个波长的测定值减小说明带宽加大。光源强度减弱或波长不准可以产生这种结果，如降低2%T，对于带宽为20nm的仪器就需要修理。460与550nm处的读数主要作为监测波长之用，称二次波长校正。这两个波长的读数相互关联，一个升高另一个就降低。如460nm的测定值（透光度）降低，而550nm的测定值升高，说明透过比色杯样品的波长小于波长度盘指示的波长（图16-2左）。反之，如460nm的测定值升高，而550的测定值降低，说明透过比色杯样品的波长大于波长度盘指示的波长（图16-2右）。

硫酸镍溶液监测仪器工作状态

图16-2 硫酸镍溶液监测仪器工作状态

实线代表波长正确时的吸收光谱，虚线代表波长不正确时的吸收光谱。箭头1表示510nm处的透光度，左右图均下降；箭头2表示460nm处的透光度，左图下降，右图升高，箭头3表示550处的透光度，左图升高，右图下降。

仪器工作状态测定后，若波长与杂光符合要求时，记录并保存各项数据，以备以后测定时对比。一般应每月监测一次，当400nm及700nm处杂光增强时，可能的原因包括：①激发光源陈旧，变黑或表层模糊不清。②透镜有灰尘。③色散元件失效等。如510nm处透光度减弱，可能原因为光源灯丝故障，比色池出光缝失灵或光栅损坏。