临床生物化学/基因库的建立

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临床生物化学

诊断分子生物学基本技术
- 分子生物学实验基础
  - 基因工程的常用工具
  - 目的基因
  - 基因库的建立
  - 核酸的分离与纯化
  - 探针制备

建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。基因库是利用工具酶，通过基因重组技术和转化、筛选而建立，也是基因克隆的过程。实际上是利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快，繁殖力强的特点，而作为一种核酸扩增筛选的载体，把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重组于其中，经筛选，克隆得到目的基因与载体重组的重组基因，成为便于保存，取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。

（一）基因重组

基因重组方案很多，简单的可用同一种限制性内切酶分别在载体和目的基因切出相对应的切口，便于连接。也可用末端连接酶合成连接器（图18-3）。近年，Okayama方案为实验室普遍采用，该方法可得到全长的cDNA。

（二）转化

转化目的是把有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞（大肠埃希菌），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下：

基因重组方案之一

图18-3　基因重组方案之一

⒈大肠埃希菌的处理（增加细胞膜通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（E.Coli cells）接种于Lb agar培养基，37℃培养一晚。挑选3~5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37℃，振摇培养一晚后，在A₅₅₀测定，要求细菌繁殖一定量（一般为细菌对数生长期），野生型（rec＋，5x10⁷cells/ml）为0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x10⁷cells/ml）为0.5-0.6。离心弃去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl₂悬浮菌体。冰浴20分钟，低温离心。弃上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl₂悬浮。4℃可保存48小时，用于转化，称competent cells。

⒉质粒（如经基因重组建立的重组质粒，基因库等）的转化将competent cells（以美国BRL公司DH10B菌株为例）置冰水浴。同时将Falcon2059（传热系数稳定）塑料试管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059试管中，加10倍稀释的巯基乙醇1μl，冰浴轻摇2分钟，放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃，轻摇45秒钟，马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩，把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管，37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟，弃上清液，用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培养皿，37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB培养液中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。

LB培养基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl，高压灭菌，pH7.5。

SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5gNaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1mol/L氯化镁与1mol/L硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加1ml于100ml培养基。

SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L葡萄糖。