组织学/一般光学显微镜术
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应用一般光学显微镜(简称光镜)观察组织切片是组织学研究的最基本方法。取动物或人体的新鲜组织块,先用固定剂(fixative)固定(fixation),使组织中的蛋白质迅速凝固,防止细胞自溶和组织腐败。常用的固定剂如酒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化锇等,一般常将几种固定剂配制成混合固定液,以抵消或减弱单种固定剂对组织的收缩或膨胀等缺点,达到更好固定效果。固定后的组织块(约3~5mm3大小)用石蜡、火棉胶或树脂等包埋(embedding)成硬块,以切片机(microtome)切成5~10μm厚的组织切片(tissue section),切片贴在载玻片上经脱蜡等步骤后进行染色。组织块也可立即投入液氮(-196℃)内快速冻结,用恒冷箱切片机(cryostat)制成冷冻切片(frozen section),这种方法制片迅速,细胞内酶活性保存较好,常用于酶组织化学染色。血细胞和分离培养的细胞可直接涂在玻片上,制成涂片(smear)。疏松结缔组织和肠系膜等软组织可撕成薄片铺在玻片上(铺片),牙和骨等坚硬组织可磨成薄片(磨片)。组织切片等标本经染色、透明后,以封固剂和盖片封固,即可长期保存,镜下观察。
图1-1 坚牢绿(酸性染料)与亚甲蓝(碱性染料)的化学结构及其染色反应示意
染色(staining)是用染料使组织切片着色,便于镜下观察。天然和人工合成的染料甚多,它们都是含发色团的有机化合物,当染料具有助色团成为盐类物质,即可溶解于水并具电荷,与组织有亲合力,使组织着色。含氨基(-NH2)、二甲氨基〔-N(CH3)2〕等碱性助色团的染料,称碱性染料(basic dye),它的盐溶液具阳电荷;含羧基(-COOH)、羟基(-OH)或磺基(-SO3H)等酸性助色团的染料,称酸性染料(acid dye),它的溶液具阴电荷(图1-1)。组织的染色原理一般认为基于化学结合或物理吸附作用。细胞和组织的酸性物质或结构与碱性染料亲合力强者,称嗜碱性(basophilia);而碱性物质或结构与酸性染料亲合力强者,称嗜酸性(acidophilia);若与两种染料的亲合力均不强者,称中性(neutrophilia)。组织的基本成分是蛋白质,构成蛋白质的氨基酸常是即有含氨基的,也有含羧基的,是两性电解质。各种蛋白质的等电点因氨基酸成分的不同而异,其电荷性质又与溶液的pH值相关,根据研究目的选用合适的染色方法,调整好染液的pH值,即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊红、坚牢绿、橙黄G等,碱性染料如苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学中最常用的是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色法,简称HE染色法。苏木精使细胞核和胞质内的嗜碱性物质着蓝紫色,伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色。
物理吸附作用的染色方法,如用苏丹染料显示脂肪组织,染料溶于脂肪内,使细胞内的脂滴显色。又如用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些结构,则是使金属微粒附着在结构表面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示,称此为亲银性(argentaffin);有些结构无直接还原作用,需加入还原剂方能显色,则称为嗜银性(argyrophilia)。还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖,当用甲苯胺蓝(toluidine blue)等碱性染料染色后呈紫红色,这种现象称为异染性(metachromasia),其原理可能是该染料在溶液中呈单体状态时显蓝色,当它与多阴离子的高分子物质耦合后,染料分子聚合成多聚体而显红色(图1-2)。还有些染色方法的原理至今还不清楚。
图1-2 异染性示意图
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