组织学/一般光学显微镜术

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组织学

组织学绪论
- 组织学研究方法
  - 一般光学显微镜术
  - 几种特殊显微镜的应用
  - 组织化学和细胞化学术
  - 免疫细胞化学术
  - 同位素示踪术
  - 原位杂交术
  - 细胞和细胞化学定量术
  - 电子显微镜术
  - 组织培养术
  - 细胞融合术

应用一般光学显微镜（简称光镜）观察组织切片是组织学研究的最基本方法。取动物或人体的新鲜组织块，先用固定剂（fixative）固定（fixation），使组织中的蛋白质迅速凝固，防止细胞自溶和组织腐败。常用的固定剂如酒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化锇等，一般常将几种固定剂配制成混合固定液，以抵消或减弱单种固定剂对组织的收缩或膨胀等缺点，达到更好固定效果。固定后的组织块（约3～5mm³大小）用石蜡、火棉胶或树脂等包埋（embedding）成硬块，以切片机（microtome）切成5～10μm厚的组织切片（tissue section），切片贴在载玻片上经脱蜡等步骤后进行染色。组织块也可立即投入液氮（－196℃）内快速冻结，用恒冷箱切片机（cryostat）制成冷冻切片（frozen section），这种方法制片迅速，细胞内酶活性保存较好，常用于酶组织化学染色。血细胞和分离培养的细胞可直接涂在玻片上，制成涂片（smear）。疏松结缔组织和肠系膜等软组织可撕成薄片铺在玻片上（铺片），牙和骨等坚硬组织可磨成薄片（磨片）。组织切片等标本经染色、透明后，以封固剂和盖片封固，即可长期保存，镜下观察。

坚牢绿（酸性染料）与亚甲蓝（碱性染料）的化学结构及其染色反应示意

图1－1　坚牢绿（酸性染料）与亚甲蓝（碱性染料）的化学结构及其染色反应示意

染色（staining）是用染料使组织切片着色，便于镜下观察。天然和人工合成的染料甚多,它们都是含发色团的有机化合物，当染料具有助色团成为盐类物质，即可溶解于水并具电荷，与组织有亲合力，使组织着色。含氨基（－NH₂）、二甲氨基〔－N（CH₃）₂〕等碱性助色团的染料，称碱性染料（basic dye），它的盐溶液具阳电荷；含羧基（－COOH）、羟基（－OH）或磺基（－SO₃H）等酸性助色团的染料，称酸性染料（acid dye），它的溶液具阴电荷（图1－1）。组织的染色原理一般认为基于化学结合或物理吸附作用。细胞和组织的酸性物质或结构与碱性染料亲合力强者，称嗜碱性（basophilia）；而碱性物质或结构与酸性染料亲合力强者，称嗜酸性（acidophilia）；若与两种染料的亲合力均不强者，称中性(neutrophilia)。组织的基本成分是蛋白质，构成蛋白质的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是两性电解质。各种蛋白质的等电点因氨基酸成分的不同而异，其电荷性质又与溶液的pH值相关，根据研究目的选用合适的染色方法，调整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊红、坚牢绿、橙黄G等，碱性染料如苏木精、亚甲蓝、碱性品红等。组织学中最常用的是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色法，简称HE染色法。苏木精使细胞核和胞质内的嗜碱性物质着蓝紫色，伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色。

物理吸附作用的染色方法，如用苏丹染料显示脂肪组织，染料溶于脂肪内，使细胞内的脂滴显色。又如用硝酸银、氯化金等重金属盐显示细胞和组织的某些结构，则是使金属微粒附着在结构表面而呈棕黑色或棕黄色。银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示，称此为亲银性（argentaffin）；有些结构无直接还原作用，需加入还原剂方能显色，则称为嗜银性（argyrophilia）。还有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖，当用甲苯胺蓝（toluidine blue）等碱性染料染色后呈紫红色，这种现象称为异染性(metachromasia)，其原理可能是该染料在溶液中呈单体状态时显蓝色，当它与多阴离子的高分子物质耦合后，染料分子聚合成多聚体而显红色（图1－2）。还有些染色方法的原理至今还不清楚。

异染性示意图