基因扩增
| A+医学百科 >> 基因扩增 |
基因扩增(gene amplification)
细胞内选择性复制DNA, 产生大量的拷贝。如两栖类卵母细胞在发育的早期，rRNA基因的数量扩增到1000多倍。基因扩增是通过形成几千个核进行的，每个核里含有几百拷贝的编码28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母细胞中的这些rRNA基因的拷贝数几乎达到50万个，而在相同生物的其它类型细胞中，这些rRNA基因的拷贝数只有几百个。卵母细胞中有如此众多的rRNA基因拷贝，为卵细胞在受精后的发育过程中合成大量核糖体创造了条件。
至于卵母细胞中rRNA基因扩增的机制，有人认为可能是通过从染色体上分离出来的环状DNA分子，这种环状DNA中含有rRNA基因，但是第一个含有rRNA基因的环状DNA是如何形成的尚不清楚。由于环状DNA能够通过滚环复制(rolling circle replication)的方式进行复制，因而能够产生大量的rRNA基因。
为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过程。在自然条件下，基因扩增是通过从染色体切除基因的重复序列再在质粒中进行染色体外复制或通过将核糖体RNA的全部重复序列生成RNA转录物再转录生成原来DNA分子的额外拷贝而实现的。在实验室已建立了不等交换、从裂解细胞提取DNA或经过滚环复制（rolling circle replication）生成染色体外序列进行人工基因扩增。例如，在非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDNA）约200个拷贝，在减数分裂Ⅰ的粗线期，这个基因开始迅速复制，到双线期它的拷贝数约为200万个，扩增近4000倍，可用于合成10的12次方个核糖体，以满足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白质的需要。在果蝇中也发现了基因扩增现象。 在卵巢成熟之前，卵巢颗粒细胞中产生卵壳蛋白的基因被扩增。果蝇中的卵原细胞，经4次分裂产生16个细胞，其中一个是卵母细胞（oocyte），将发育成为卵细胞，其他15个是营养细胞（nurse cell），它们为卵细胞的形成提供大量的蛋白质及其他大分子物质，营养细胞之所以能够产生大量的营养物质，是因为它们在形成的过程中发生了多次特殊的DNA复制，卵壳蛋白等基因拷贝数显著增加。
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
PCR：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR是在体外由酶促合成特异DNA片段的一种新方法。在反应液中含有模板DNA、人工合成的目的片段的5′端和3′端PCR引物、合成DNA的四种脱氧核苷酸底物（dNTP）、一种耐热的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各种离子的缓冲液。此反应体系由高温变性、低温复性及适温延伸等步骤共同组成一个周期，然后反复循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是，待扩增的模板DNA在94℃高温下解链成为单链DNA；低温复性时人工合成的两个寡聚核苷酸引物分别与目的片段两条链的两端互补结合；在72℃时Taq酶可将dNTP从引物3′端开始掺入，沿模板DNA5′→3′方向延伸，合成一条新的互补链。由于每一周期所产生的新DNA链均能成为下一循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25~30个周期后，一般可扩增至106~107。PCR技术由于有操作简便、省时间、特异性及敏感性均较高等特点，所以一经问世，就得到了广泛的应用，许多条件较差的实验室，也得以开展分子生物学研究，故可看作是分子生物学技术的一次革命。在PCR反应的各种成分中，模板DNA和引物是两个重要因素，虽然PCR敏感性很高，可以检测微量DNA的用量，以不低于0.1μg为宜。模板DNA的纯度要求不是很严格，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶及Taq酶抑制剂。引物是决定PCR结果的关键，引物长度以15~30个碱基为宜；（G+C）约占总碱基中的50%；两个引物之间不应发生互补；应尽量减少重复的碱基，特别是在3′端。PCR可用于扩增DNA或RNA。在扩增RNA时必须先用反转录酶合成cDNA第一链，然后进行PCT扩增，这种方法称为逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。目前PCR技术在肿瘤研究中也得到广泛的应用。例如从肿瘤细胞提取基因组DNA然后用设计好的对某个基因特异的OCR引物，如p53基因第5~8外显子的引物，进行PCR扩增，然后用单链DNA构型多态性（SSCP）分析技术或直接DNA测序技术，研究p53基因的点突变。RT-PCR技术广泛应用于检测某个癌基因、抑癌基因或其他肿瘤相关基因的过度表达或低表达。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现
1985年国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
| 关于“基因扩增”的留言： |  订阅讨论RSS
|
|
目前暂无留言 | |
| 添加留言 | |