医学遗传学/限制性片段长度多态性

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医学遗传学基础

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  - 限制性片段长度多态性

一个人的两套单倍体 DNA是不完全相同的，一般每100－500个碱基对就有一个是不相同的。换言之，如果把两套基因组DNA（各3.2×109bp）排列起来，那么平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。实际上，除单卵双生子外，人群中没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。

DNA的多态性虽可通过DNA测序检出，但用限制酶消化却是最常用的检测方法。

1．RFLP由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异（图13-3），这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragmentlength polymporphism, RFLP）。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法（见下节）检出。用Southern杂交检出RFLP时，如探针跨越切点，则被切开的两个片段均可与探针杂交，从而显示两条杂交带（图13-4）。

RFLP示意图箭头酶切位点

图13-3 RFLP示意图箭头酶切位点；

左图：等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb;

右图：DNA片段电泳后杂交图

RFLP的检出等位基因

13-4 RFLP的检出等位基因1因有额外切点而导致产生

两个长短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能与探针杂交

2．两点RFLP

（1）点态（point polymorphism）：是由于单个或少数碱基的改变引起酶切点的出现或消失所致的RFLP。上述的RFLP即属于这一类。它们属经典的RFLP。在人类基因组中已发现数以百计的此类多态位点。

（2）数目变异的串连重复（variable number tandem repeats,VNTR）：上述经典的单个碱基取代所致的RFLP一般只能检测到一种杂合性的两种形式，即“有”或“无”某个限制酶切位点，而且每个位点在人群中的杂合子频率通常不会超过50％，当被测个体为纯合状态时，利用RFLP就无法得到所需要的多态信息。此外，在整个基因组中，这类RFLP目前发现的数量还有限，并分布不匀。

但是，在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每一个单位通常只有16-28bp长，但其重复次数在人群中是高度变异的。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段（图13-5）

与小卫星DNA不同，另一类重复序列是卫星DNA。它们的基本序列有1－6bp，如（TA）n、(CGG)n等，通常重复10-60次并呈高度的多态性。

VNTR导致的RFLP重复次数的变异致酶切位点的移动和DNA片段长度的变异