医学遗传学/限制性核酸内切酶

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  - 限制性片段长度多态性

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease），又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段.限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。

限制酶主要来源于原核生物，是一组能水解DNA磷酸二酯键的酶。迄今已发现的限制酶多达数百种，分为三类。在基因工程中使用的主要是第二类。限制酶根据其来源命名。例如，限制酶EcoRⅠ来源于大杆菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在该菌株中分离的第一个限制酶。

下面是一些最常用的限制酶的来源及其识别顺序(表13-1)

每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点(restriction sites)或切点.限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端（cohesive terminus）；第二种为平整切割，即两　

表13-1 常用的限制酶的来源及其识别顺序列

名称

识别序列

来源

Ava

C↓(	C	)CG(	A	)G
	T		G

Anabaena variabilis

Bam H

G↓GATCC

Bacillus amyloliquefaciens H

Bgl Ⅱ

A↓GATCT

Bacillus globigii

Eco RⅠ

G↓	*	ATTC
	A

Escherichia coliRY13

Eco RⅡ

↓CC(	A	GG
	T

Escherichia coliR245

HaeⅢ

GG↓	*	C
	C

Haemophilus aegyptius

HindⅢ

*	↓AGCTT
A

Hemophilus influenzae Rd

HpaⅠ

GTT↓AAC

Haemophilus parainfluenzae

HpaⅡ

C↓	*	GG
	C

同上

KpnⅠ

GGTAC↓C

Klebsiella pneumoniae

MboⅠ

↓GATC

Moraxella bovis

PstⅠ

CTGCA↓G

Providencia stuartii

被甲基化

条链在同一水平切开，得到平齐末端（blunt terminus）(图13-2)。由于具有相同粘性

限制酶的两类切割方式

图13-2 限制酶的两类切割方式

末端的DNA片段在DNA连接酶的作用下很容易共价连接，因此被广泛地应用于重组DNA操作中。具有相同平齐末端的DNA片段也可以连接，但连接效率只有粘性末端连接效率的1％。

限制酶的上述特性在基因工程和基因诊断中具有重要用途：①首先不论DNA的来源如何，用同一种内切酶切割后产生的粘性末端很容易重新连接，因此很容易将人和细菌或人和质粒任何两个DNA片段连接在一起，即重新组合，这是重组DNA技术的基础。②人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。限制酶能把基因组在特异的部位切开，即切割不是随机的，因而从每个细胞的基因组得到的是相同的一组长度各异的片段。这些可能含有某一基因的片段可用电泳分离，并加以研究。③由于限制酶的特异性，如果识别位点的碱基发生了改变，限制酶将不再能切割；同样，碱基的改变也可能导致出现新的酸切位点。在人类基因组中，这两种情况是十分常见的，而切点的消失或出现将影响获得的DNA片段的长度，表现为限制性片段长度多态性（RFLP），这在基因的连锁诊断中具有极重要的意义。