医学免疫学/体液免疫功能的检测

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医学免疫学

免疫学检测法
- 抗原或抗体的检测
- 体液免疫功能的检测
- 细胞免疫功能的检测
- 分子生物学技术在免疫学诊断中的应用

临床上一个反复发作的化脓感染，常使医生想到患者是否有免疫缺陷病，一般原发免疫缺陷发病年龄很小，而继发免疫缺陷病人多在30岁以上。绝大多数免疫缺陷病人多表现为体液和细胞免疫同时受损，所以应全面检查这两方面的功能。遗憾的是，目前应用的检测方法的局限性，其结果常难以得出明确结论。

一、免疫球蛋白的定量检测

1．血清免疫球蛋白的测定　血清免疫球蛋白（Ig）的测定是检查体液免疫功能最常用的方法。由于目前还没有发现由IgD和IgE缺陷所致疾病，所以通常检测IgG、IgM、IgA，这三类Ig就可以代表血清Ig的水平（表20-2）。检测发现三类Ig水平均明显低下，就可考虑体液免疫缺陷。但在分析儿童Ig水平时，应注意Ig的水平随年龄而变化。体液免疫功能缺陷首先考虑患者血清Ig　水平，如果所有类别Ig水平均降低，即称为一般性联低丙种球蛋白血症。如果免疫球蛋白水平极度低下，或IgG、IgM、IgA,三类Ig总量低于2mg/ml则称为严重低丙种球蛋白血症或无丙种球蛋白血症(agammaglobulinemia)。如果只一种或两种Ig水平降低，则称为异常丙种球蛋白血症（dysgammaglobulinemia）。一般性低丙种球蛋白血症多见于继发性免疫缺陷病。无丙种球蛋白血症常见于原发免疫缺陷病。但是常有约50%IgA缺陷病人无临床症状，伴有反复感染的IgA缺陷病人常同时有IgG的缺陷。常规的定量检测血中Ig的方法是单向免疫扩散和免疫比浊法。

表20－2　人类血清免疫球蛋白正常量

类别	变化较大时期（mg/ml）	达到成人水平与均值
IgG	1 ～5岁～10.0 4 ～8岁 8.0 ～10.0 9 ～13岁 10 ～11.0	8岁以后 12．0±2.6mg/ml (150±321IU/ml)
IgA	1 ～2岁 4 ～8岁 1～1.5 9 ～13岁 1.5～2.0	12岁以后 2．0±0.5mg/ml (140±36IU)/ml)
IgM	1 ～4岁 4 ～8岁 1.0 9 ～13岁 1.0	男性1岁女性2岁 1.1±0.3mg/ml (130±40IU)/ml)

注：IU=国际单位

2．分泌型IgA(SIgA)的测定 SIgA是粘膜抗感染的重要因素，但是粘膜抗感染还包括少量渗出的IgM和IgG，还有细胞免疫的作用。由SIgA缺陷病人常可检测出针对牛奶或其他食物蛋白的沉淀抗体和自身抗体，说明机体对抗原蛋白质吸收异常，同时也存在免疫调节系统的功能紊乱。一般来说血清IgA缺陷病人常伴有SIgA缺陷，反之亦然。说明在机体中血清IgA和SIgA之间有某种生物相关性。最近也有报导少数SIgA缺陷病人的血清IgA水平正常，因而分别检查血清中和分泌液中IgA水平还是有必要的。目前用免疫比浊法可较精确地测定分泌液中IgA时和IgM和IgC水平。在用单向免疫扩散和免疫比浊法定量IgA时，因抗血清是针对这两型共有的α链的，故不能区分SIgA和血清来源的IgA。而应用抗分泌小体的抗体用酶免疫分析法，可区分血清IgA和分泌型IgA,并可对SIgA进行定量。

二、常见抗体的测定

检测体液免疫功能的另一种方法是定量测定正常人体内的几种常见的抗体水平。常见的抗体通常是指嗜异性凝集素、抗溶血素O抗体以及麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒的抗体。

在严重免疫缺陷病人缺乏上述抗体，常见抗体的缺损可验证或支持免疫蛋白测定的结果。然而对于比较复杂的免疫缺陷，由于这类抗体主要反映过去的免疫应答能力，此外这种初次应答能力持续期短，易于消退，所以对新近发生的继发性免疫缺陷的诊断帮助不大。

三、B细胞数目及功能的检测

原发性免疫缺陷和继发性免疫缺陷均可导致体液免疫功能下降。原发性体液免疫功能缺陷可能由于B细胞分化障碍，细胞内合成Ig功能紊乱或由于抑制性细胞功能过强。继发性体液免疫功能降低可能由于蛋白质大量丢失，蛋白质吸收障碍、营养不良、免疫抑制治疗的副作用，病毒感染（艾滋病）等。在诊断原发性体液免疫功能缺损中可检查B细胞的数目和功能以确定造成缺损的原因。

1．外周血B细胞数目的检测首先进行常规的外周血白细胞总数和分类计数检查，这些结果是评价病人免疫系统功能状态的基本资料。由于在全血中淋巴细胞所占比例很少，而T细胞和B细胞不能藉形态学特征分类，所以外周血B细胞数检测需先从全血分离出富含淋巴细胞的单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell,PBM）。再依靠B细胞表面有免疫球蛋白分子或其他特征来检查B细胞。常用的方法是将待检者的PBM用FITC标记的免疫抗人Ig作直接免疫荧光染色，在荧光显微镜下显荧光的细胞为带有表面免疫球蛋白的B细胞。正常人B细胞的约占PBM的10%。

2．外周血B细胞功能的检测 分离受检者血液PBM细胞，体外培养时加入B细胞刺激物如RWM（美洲商陆刺激素）或SAC（金黄色莆萄球菌来源的刺激物）后由B细胞变成Ig分泌细胞的数量。体液免疫功能缺损患者，其PBM对PWM和SACA刺激的反应降低，产生Ig分泌细胞数正常人显著减少。在进一步检查这种免疫缺损的原因，则应检查是由B细胞或TH细胞缺损所致，还是由于TS细胞数量或活性增强引起的。

抗体形成细胞计数：检查人类Ig分泌细胞是用反向溶血空斑检测（reversed hemolytic　plaque assay）法。将待检人的PBM、用SPA包被的SRBC（SPA-SRBC）、兔抗人Ig抗体、补体四种成分混合，灌入用两张玻片做成的小室，密封好，放入温箱培养1-3小时，，在此期间，作为抗人Ig抗体的免疫IgG的FC段可与SRBC表面SPA结合，当Ig分细胞分泌出游离的Ig分子时，这些人Ig分子与SRBC表面的抗人Ig抗体结合形成免疫复合物，即可活化补体，使SPA-SRBC溶解，因此在Ig分泌细胞周围形成一个圆形的溶血区，称为溶血空斑，每一个溶血的空斑就代表一个Ig分泌细胞。

检查小鼠Ig分泌细胞应用的溶血空斑试验比较简单，即SRBC免疫注射小鼠，4天后取脾制成单个细胞悬液，加入一定量SRBC（靶细胞）混合，在补体参加下，产生抗体的细胞分泌出的Ig与SRBC（抗原）结合在补体作用下，溶血，表现肉眼可见的溶血空斑。计数空斑数代表分泌抗体的细胞数。