临床生物化学/核酸扩增技术

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{{Hierarchy header}} 通过[[大肠埃希菌]]繁殖而[[增殖]][[重组质粒]]，也是[[扩增]][[核酸]]的手段。但在[[试管]]中有效扩增[[DNA]]的方法，是在90年代才开展起来的[[多聚酶]]链反应（polymerase chain reaction，PCR）新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便，在我国发展很快。目前，PCR技术结合[[分子]][[生物学]]实验技术（如[[逆转录]]反应杂交技术等）开发了许多PCR新技术（reverse transcriptase PCR；PCR-single strandconformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；热启动PCR等）。RT-PCR用于[[RNA]]分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于[[点突变]]分析；二次PCR特异性好，灵敏度高；热启动PCR可提高特异性。 PCR技术原理是在了解DNA[[一级结构]]基础上设计[[引物]]（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可识别并结合引物，以[[单链DNA]]为模板，dNTP为[[底物]]，合成其互补链。通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到DNA扩增的目的。人的DNA[[扩增引物]]长度多为20个核甘酸。（图18-7） {{图片|gor4vvzo.jpg|PCR技术原理}} 图18-7　PCR技术原理 PCR反应：DNA样品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，gelatin（[[明胶]]）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，矿物油一滴。93℃7分钟→50-55℃2分钟→70-72℃3-1.5分钟→93℃2分钟。 {{图片|gor4vrys.jpg|}} 将反应物和Marker点样于[[凝胶]]一起电泳，紫外光下观察结果，拍照保存结果。反应物也可用于印迹（杂交）实验、多态分析、[[探针]]制备等。 注意事项：①DNA样品纯度高，Taq酶（和Klenow酶）有[[逆转录酶]]活性，DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内（特别3′端）和引物，1，2分子间不形成双链。选择性好，不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G+C含量为40％-60％。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误，一般在200μmol/L，有人建议40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L对酶有抑制作用。[[Mg]]²⁺浓度过高，NDA不易变性，＞10mmol/L可抑制[[酶活性]]40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶从[[嗜热菌]]分离得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次[[热变性]]要补加一次酶），现在经[[基因]]克隆的[[重组体]]产物Taq酶最适pH8.3～8.8（室温8.3-8.4），反应温度75-80℃，95℃以上[[失活]]明显。无3′→5′校读活性，对SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加[[吐温]]－20可抵制SDS抑制）。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm－5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性退火，而造成非特异扩增，此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多，增加次数可提高灵敏度，但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高，被检样品极易被污染，样品[[纯化]]，扩增，检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃，处理。 {{Hierarchy footer}} {{临床生物化学图书专题}}

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